新疆紅棗黑斑病病原菌鑒定及拮抗細菌篩選

包慧芳，王 寧，侯 敏

（新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091）

新疆紅棗黑斑病病原菌鑒定及拮抗細菌篩選

包慧芳，王 寧，侯 敏

（新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091）

【目的】對新疆紅棗黑斑病病原菌進行分離、鑒定，確定新疆紅棗黑斑病病原菌種類種屬，并進行拮抗細菌篩選，為新疆紅棗黑斑病的防治奠定基礎。【方法】從新疆阿克蘇和喀什分別采集染有黑斑病的灰棗和駿棗樣品，采用可培養方法，進行病原菌分離鑒定，測定其生長最適培養基、溫度、pH值；并從未發病棗園及發病棗園但未染病紅棗樹下采集土壤樣品，采用平皿對峙法進行拮抗菌篩選。【結果】從灰棗和駿棗上分別分離獲得1株病原菌，根據菌株形態及分子測序結果表明，2株菌均為鏈格孢屬菌種（Alternaria alternata），并篩選獲得2株優良的拮抗菌 JK1（多粘類芽孢桿菌 Paenibacillus polymyxa）和 JK5（枯草芽胞桿菌Bacillus sutilis）。【結論】新疆紅棗黑斑病病原菌為鏈格孢屬鏈格孢（Alternaria alternata），其生長最適培養基為 PDA，最適生長溫度為30℃，最適生長pH值為6～7，菌株 JK1和JK5對病原菌生長具備明顯的抑制作用。

紅棗黑斑病；病原菌；鑒定；拮抗菌

0 引 言

【研究意義】紅棗是新疆近年來發展最快、效益最突出、惠民成效最顯著的一項特色林果產業。截至目前，新疆紅棗種植面積已居全國第 2位。隨著紅棗種植規模迅速擴大，矮化密植栽培模式廣泛采用，但綜合管理水平相對滯后，導致紅棗病害時有發生，黑斑病是近年發生的最嚴重的病害之一，2011年部分果園紅棗黑斑病發病率達到70%，近兩年發病率在30%左右。目前有關紅棗黑斑病病原菌種類報道不一，對新疆紅棗黑斑病病原菌進行分離，鑒定，確定其種屬及生物學特性，并對其拮抗菌進行篩選，對新疆紅棗黑斑病的生物防治將具有重要意義。【前人研究進展】有關紅棗黑斑病病原菌種類的報道存在很大的差異：吳玉柱［1］、王軍等［2］報道冬棗黑斑病病原物是細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）；李夏鳴等［3］報道引起棗果實黑斑病的致病菌是 Alternaria tenuissima（Fr）Wiltsh和 Alternaria sp.，袁高慶等［4］報道冬棗果實病黑斑病主要是由鏈格孢屬鏈格孢（Alternaria alternata）侵染引起；而林忠敏等［5］報道山西省紅棗黑斑病病原菌為交鏈孢屬（Alternaria tenuis）和莖點屬（Phoma sp.）；李曉軍［6］、王樹禮等［7］認為冬棗黑斑病由黃單胞桿菌屬（Xanthomonas）和假單胞桿菌屬細菌（Pseudomonas）感染引起；宗淑萍等［8］認為桑殼小圓孢菌（Coniothyrium fucsidulum）、仁果莖點霉（Phoma pomirum）是主要的病原菌，而鏈格孢（Alternaria alternata）只是參與了侵染；靳增軍等［9］報道河北冬棗黑斑病病 原物 為 毀 滅 莖點 霉 （Phoma destructiva Plowr．）和鏈格孢（Alternaria alternata）兩種；趙文華等［10］報道云南省紅河州梨棗、雞蛋棗等棗黑斑由交鏈孢屬（Alternaria sp.）、莖點霉屬（Phoma sp.）和毛盤孢屬（Colletortrichum sp.）真菌混合侵染。另外，目前關于紅棗黑斑病拮抗菌的篩選鮮有報導。【本研究切入點】目前關于紅棗黑斑病病原菌種類報道存在較大差異，此差異是否與種植地氣候、種植品種有關。【擬解決的關鍵問題】研究從新疆喀什、阿克蘇采集樣品，進行黑斑病病原菌分離，鑒定，確定新疆紅棗黑斑病病原菌種類，對其進行生物學特性研究和拮抗菌篩選，為新疆紅棗黑斑病的生物防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品

2013年 10月，分別從喀什伽師縣、疏勒縣、阿克蘇第一師、第二師等地多個棗園采集黑斑病病棗樣品10份，每份樣品數量大于20個，采集品種為主栽品種駿棗和灰棗。

1.1.2 試 劑

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂、蔗糖等均為國產分析純試劑，引物、dNTPs、Taq酶等試劑均購自上海生工生物技術服務有限公司。

1.1.3 培養基

（1）NA培養基：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，NaCl 5 g，瓊脂粉 15 g，蒸餾水定容至 1 000mL，pH 7.2，121℃滅菌20 min，用于細菌分離培養。

（2）PDA培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 000mL，121℃滅菌20 min，用于真菌分離培養。

（3）PCA培養基：土豆 20 g，胡蘿卜 20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 000mL，121℃滅菌20 min，用于真菌培養。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分離

將所采集的10份紅棗樣品每份挑選10個，共計100個，進行表面消毒，具體方法如下：選好樣品，無菌操作臺中用 75%乙醇漂洗20～30 s，無菌水漂洗4次；5%次氯酸鈉溶液漂洗5 min，無菌水漂洗4次；75%乙醇漂洗20～30 s，無菌水漂洗 4次，無菌濾紙吸干。

消毒完畢，將棗果剝開，用無菌鑷子夾取病健交接處果肉組織，分別接種至 NA、PDA培養基平板上，一個平板接種來自一顆棗果的果肉組織約3～4塊。接種后的平板放入30℃恒溫培養箱中，培養2～7 d至病原菌明顯生長。

對于細菌，從平板上挑取形態顏色不同的單菌落，繼續在新的平板上劃線純化 2～3次，獲得菌種純培養物，并給菌株編號。對于真菌，從顯微鏡下挑取單孢子，進行培養，并編號。

1.2.2 細胞的形態觀察

對于細菌，將菌種劃線接種至NA平板，待菌落長出后，挑取菌落，固定至載玻片，染色，OLYMPUS CX21FS1顯微鏡下觀察其細胞形態并拍照；對于真菌，將菌種劃線接種至 PDA平板，同時將無菌蓋玻片斜插于PDA培養基中，置30℃恒溫培養箱中培養2～3 d，將蓋玻片取出置于載玻片上，OLYMPUS CX21FS1顯微鏡下觀察其細胞形態并拍照。

1.2.3 病原菌序列測定

將培養好的菌種，采用Zymo Research公司的Fungal／Bacterial DNA Miniprep TMD6005試劑盒進行基因組DNA提取，細菌以16S rRNA通用引物（27F：5＇－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3＇，1492R：5＇－GGTTACCTTGTTACGACTT－3＇）為引物，真菌以18s rRNA通用引物（ITS1：5＇－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3＇，ITS4：5′－TCCTCCGCTTAT－TGATATGC－3′）及β－微管蛋白（β－tubulin）基因引物（Beta－F：CAGCTCGAGCGTATGAACG－TCT，Beta－R：CGGAAGTCGGAAGCAGCCATC）進行PCR擴增，PCR反應體系為：10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol／L dNTP Mixture 4 μL，Taq DNA聚合酶 0.25 μL（TaKaRa，5 U／μL），引物（20 μmol／L）各1 μL，基因組DNA 1 μL，使用去離子水將反應總體積補充至50 μL。細菌PCR反應條件為：95°C，5 min；95°C，45s，57° C，30s，72°C，1.5 min，30 cycles；72°C，7 min。真菌PCR反應條件為：95°C，5 min；95°C，30s，55° C，30s，72°C，1 min，30 cycles；72°C，7 min。產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并使用DNA凝膠回收試劑盒純化。將純化產物送至北京鼎國生物技術有限公司進行序列測定，所得序列提交 Gen-Bank數據庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov），申請基因登陸號，同時進行Blast比對。

1.2.4 病原菌致病力測定（回接試驗）

采集白熟期健康棗果（采果前半個月停止使用殺菌劑），用70%酒精對棗果表面進行消毒，無菌水沖洗3次。對于病原細菌，采用LB液體培養基培養12～24 h，制成菌懸液，使用時采用無菌水將濃度調整為約1×107個細胞／mL。對于病原真菌，接種至 PDA培養基上培養5～7 d后，取菌落攪碎，加無菌水制成孢子懸浮液，濃度為每視野20～40個孢子（400X）。如分離獲得多個病原菌，試驗設置病原菌單獨接種和混合接種，每個處理又分為有傷和無傷2種方式，以無菌水作對照，每處理60個果實。有傷處理即用滅菌的醫用針頭刺傷果皮造成傷口接種。回接后每天觀察發病情況，統計發病率。待接種棗果充分發病后，每處理選擇50%的樣品進行病原菌的再分離，并對再分離獲得的病原菌進行形態及分子鑒定。

1.2.5 測定項目

1.2.5.1 生長溫度

配制 PDA培養基，每皿中接入直徑 8 mm的菌餅一個，每處理3個重復，分別置于10、20、30、40和50℃培養，5 d后測其直徑，獲得每處理平均直徑。

1.2.5.2pH值

用1 mol／L HCl和1 mol／L NaOH配制pH值分別為4、5、6、7、8、9的 PDA培養基，每處理 3個重復，每皿中接入直徑8 mm的菌餅一個，置于25℃培養120 h后測其直徑，獲得每處理平均直徑。

1.2.5.3 培養基

配制 PDA和 PCA兩種培養基，每處理3個重復，每皿中接入直徑8 mm的菌餅一個，置于25℃培養5 d后測其直徑，獲得每處理平均直徑。同時在PDA和 PCA上分別劃線培養，觀察生長狀態。

備注：測量菌落直徑時，通過菌落中心劃直線，用直尺測量并記錄。

1.2.6 拮抗細菌篩選及鑒定

從未發病棗園及黑斑病高發棗園采集未染病紅棗樹下土壤樣品，稱取 10 g土壤，溶解于 100mL無菌水，制成懸液。同時將病原菌接入查氏培養基，30℃培養48 h。將土壤懸液及菌懸液按梯度稀釋（100、1 000、10 000倍），各取100 μL共同涂布于1／2NA＋1／2PDA平板上置30℃培養5～7 d。對周圍出現了病原菌抑制圈的細菌，進行純化培養，再次進行平皿對峙實驗，對其中有明顯拮抗效果的菌株采用1.2.3的方法進行DNA提取，并送至鼎國進行分子鑒定。對所測得序列提交GenBank數據庫 （http：／／www.ncbi.nlm.nih. gov），申請基因登陸號，同時進行 Blast比對及系統進化樹制作。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離

參照1.2.1的方法將100個黑斑病紅棗樣品進行表面消毒及病原菌分離。研究表明，所有樣品均沒有細菌性病原菌生長，只獲得真菌性病原菌，分離頻率為 99%。所得病原菌菌落中心深褐色，由內向外逐漸變淺，略顯綠色，最邊緣顯白色。挑取病原菌單孢子進行培養，獲得純培養病原菌。圖1

圖1 帶病組織塊病原菌分離結果Fig．1 Isolation of pathogen of jujube black spot disease

2.2 病原菌形態觀察

挑取菌株單孢子接種于 PDA培養基并進行傳代培養，研究表明，菌株在 PDA培養基上菌絲為白色，呈放射狀擴展，氣生菌絲很發達，菌絲體茂密，3 d后菌絲顏色逐漸變深，最后變為灰褐色至黑色。分生孢子梗暗色，單枝或多枝，長短不一，頂生分生孢子。分生孢子暗色，有1～9個橫隔膜，2～4個縱隔膜，倒棍棒形、橢圓形或卵形，基本符合鏈格孢屬鏈格孢（Alternaria alternata）孢子形態。圖2

圖2 病原菌菌落及菌體形態Fig．2 Colony and cell morphology of the pathogen

2.3 病原菌分子測序

對病原菌進行基因組DNA提取，以所得基因組為模板，以18S rRNA和β－微管蛋白（β－tubulin）基因引物為引物進行PCR擴增，對擴增產物進行序列測定。將所獲得序列提交至 GenBank數據庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov），進行Blast比對，結果表明，所分離菌株為同一株菌，其18S rRNA序列與鏈格孢屬菌種（Alternaria sp.）18S rRNA序列同源性為99%，申請基因登陸號為KT287103。結合β－微管蛋白（β－tubulin）基因比對結果，將該菌種命名為鏈格孢屬鏈格孢（Alternaria alternata），作出病原菌系統進化樹。圖3

2.4 病原菌致病力測定（回接試驗結果）

按照1.2.4方法進行，此次病原菌致病力測定結果表明，采用有傷處理回接病原菌的發病率為93%，無傷處理回接病原菌發病率為48%，有傷對照發病率為3%，無傷對照發病率為0%。對發病紅棗進行病原菌再分離，分離頻率為99%，對再分離病原菌進行形態觀察及分子鑒定，所得病原菌與所接病原菌一致。部分紅棗回接病原菌后發病癥狀。圖4，表1

圖3 病原菌系統進化樹Fig．3 Phylogenetic tree of the pathogen

表1 病原菌回接發病率Table 1 Incidence rate of re－inoculation

圖4 部分紅棗回接病原菌后發病癥狀Fig．4 Symptoms of part jujub after inoculation

2.5 生長特性檢測

采用1.2.5的方法進行了生長溫度、pH值、培養基對病原菌生長的影響。不同培養基生長結果表明，病原菌在 PDA上生長平均直徑為 5.88cm，在 PCA上生長平均直徑為 5.83cm；劃線培養結果表明，病原菌在 PDA上生長致密，在 PCA上生長稀疏。不同生長溫度、pH值菌落生長直徑測定結果表明，該病原菌最適生長溫度為30℃，最適生長pH為 6～7，最適生長培養基為 PDA。表2

表2 不同溫度和pH值下菌落生長變化Table 2 Effects of different temperature and pH on colony growth

2.6 拮抗菌篩選

通過初篩獲得14株有抑制圈的菌株，命名為JK1－JK14，對此14株菌純化后進行平皿對峙實驗，研究表明，其中JK1和JK5對紅棗黑斑病病原菌有明顯的拮抗作用。對JK1和JK5進行分子鑒定，所得序列提交 GenBank數據庫（http：／／www. ncbi.nlm.nih.gov），申請基因登陸號分別為KU563771和KU563772，同時進行 Blast比對及系統進化樹制作。JK1為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），JK5為枯草芽胞桿菌（Bacillus sutilis）。圖5

圖5 JK1、JK5系統進化樹Fig．5 Phylogenetic tree of JK1 and JK5

3 討 論

對于鏈格孢屬菌種，分生孢子的大小、形狀、顏色、孢子表面的紋飾、分隔情況、產孢表型、喙的有無和形態等是其種的主要分類標準，菌絲特征、菌落特點、分生孢子梗的形態、寄主范圍等是種級分類的輔助依據。但分生孢子的形態和大小在人工培養的條件下，變化幅度較大，并且不同種的分生孢子形態和大小在營養豐富的人工培養基上具有趨同現象，給準確鑒定到種帶來了很大的困難。絲孢真菌的β－微管蛋白基因具相當高的保守性［11］，因此研究結合了孢子形態、18S rRNA、β－微管蛋白基因來對所獲得病原菌進行鑒定，提高了病原菌種屬定名的準確性。

研究分離得到的紅棗黑斑病病原菌為 Alternaria alternata，與向征［12］、劉曉琳［13］、董寧［14］、劉振亞等［11］報道的一致，而與吳玉柱［1］、林忠敏［5］、宗淑萍［8］、趙文 華等［10］報道 的不一 致。研 究表明，此差異可能與紅棗品種、種植地域及氣候差異相關，因此后期有必要進行更系統深入的研究，探索紅棗品種、種植地域、氣候與紅棗病害之間的關系。

目前有關紅棗黑斑病拮抗菌有少量報道，主要為枯草芽胞桿菌（Bacillus sutilis）［15］，研究除篩選獲得1株枯草芽胞桿菌 JK5，還獲得 1株多粘類芽孢桿菌 JK1（Paenibacillus polymyxa）。研究表明，多粘類芽孢桿菌產生的多肽類抗菌物質對植物病原真菌具有很好的拮抗活性，且性質比較穩定，是極具開發前景的生防細菌［16］，因此后續研究中，可以對多粘類芽孢桿菌及枯草芽胞桿菌發酵工藝、拮抗效果進行研究，為紅棗黑斑病生物防治奠定基礎。

4 結 論

從灰棗和駿棗上分離篩選，獲得同一種病原菌，根據菌株孢子形態及分子測序結果，該病原菌為鏈格孢屬鏈格孢（Alternaria alternata）。其最適生長溫度為30℃，最適生長pH值為6～7，最適培養基為 PDA。

研究篩選獲得兩株效果較好的拮抗菌JK1和JK5分別為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）和枯草芽胞桿菌（Bacillus sutilis）。

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Identification of the Pathogen and Screening of the Antogonistic Bacteria of Jujube Black Spot Disease in Xinjiang

BAO Hui－fang，WANG Ning，HOU Min
（Research Institute of Applied Microbiology，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China）

【Objective】In order to lay the foundation for the prevention and control of jujube black spot disease in Xinjiang，the pathogen and its antagonisitic bacteria will be screened and identificated.【Method】Jujube samples with black spot disease were collected from Aksu and Kashi.The pathogen were cultured and identified.Biological characteristic were examined such as the optimum medium，temperature and pH.The antogonistic bacteria of jujube black spot disease were also screened from the soil samples collected from the jujube garden by the plate confrontation method.【Result】Two strains were obtained from different Jujube varieties and identified as Alternaria alternata according to the 16S rRNA sequence analysis and biochemical characteristics.Two antogonistic bacteria JK1（Paenibacillus polymyxa）and JK5（Bacillus sutilis）were obtained.【Conclusion】The pathogen of jujube black spot disease in Xinjiang is Alternaria alternata，the best medium is PDA，the optimum temperature is 30℃ and the optimum pH is 6－7.JK1（Paenibacillus polymyxa）and JK5（Bacillus sutilis）has obvious inhibitory action for Alternaria alternata.

jujube black spot disease；pathogenic bacteria；identification；antagonist

S436.65

A

1001－4330（2016）09－1667－07

10.6048／j.issn.1001－4330.2016.09.014

2016－03－11

新疆維吾爾自治區自然基金項目（2015211A031）；新疆農業科學院青年基金項目（xjnkq－2013001）；國家微生物資源平臺專項（NIMR－2013－1－1）

包慧芳（1978－），女，湖南華容人，副研究員，研究方向為農業微生物及其應用，（E－mail）bhfcfs＠126.com

（Cotresponding author）：王寧（1979－），女，山東人，副研究員，研究方向為微生物資源利用，（E－mail）150700126＠qq.com

Fund project：Natural Science Foundation of Xinjiang（2015211A031）；Xinjiang Academy of Agricultural Sciences Fund for Young Scientists Fund（xjnkq－2013001）；National Platform Project of Microbial Resources（NIMR－2013－1－1）