黃瓜子葉細(xì)菌性果斑病菌侵染初期cDNA文庫的構(gòu)建及質(zhì)量評(píng)價(jià)

胡金鳳，劉 君

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052）

黃瓜子葉細(xì)菌性果斑病菌侵染初期cDNA文庫的構(gòu)建及質(zhì)量評(píng)價(jià)

胡金鳳，劉 君

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052）

【目的】構(gòu)建黃瓜子葉細(xì)菌性果斑病菌侵染初期的cDNA文庫，研究細(xì)菌性果斑病菌與黃瓜相互作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。【方法】以接種細(xì)菌性果斑病菌4 d的 Chinese long品種自交系9930黃瓜子葉為材料，分離純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，利用同源重組的方法將雙鏈cDNA轉(zhuǎn)移到酵母雙雜交載體 pGADT7中，獲得cDNA文庫，對(duì)該文庫質(zhì)量進(jìn)行分析。【結(jié)果】提取的黃瓜子葉總 RNA電泳檢測出3條特異性條帶，分離純化的 mRNA電泳檢測呈彌散條帶；反轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA電泳條帶呈彌散狀均勻分布，大小分布在850～4 000 bp；黃瓜子葉cDNA文庫的庫容量達(dá)2.2×106CFU／mL，文庫重組率為95.8%，文庫插入片段的平均長度在1.5 kb左右，達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫的要求?！窘Y(jié)論】所獲得的文庫質(zhì)量較高，可以用于進(jìn)行與功能蛋白相互作用的篩選及研究細(xì)菌性果斑病菌與黃瓜相互作用的分子機(jī)制。

細(xì)菌性果斑病菌；黃瓜子葉；同源重組；酵母雙雜交cDNA文庫

0 引 言

【研究意義】由西瓜食酸菌（Acidovorax citrμlli）引起的細(xì)菌性果斑?。˙acterial Fruit Blotch，BFB）是一種可以對(duì)黃瓜、西瓜、甜瓜等葫蘆科植物造成毀滅性危害的種傳病害［1］。1965年報(bào)道 BFB的發(fā)生是在美國喬治亞洲幾個(gè)西瓜品系幼苗上［2］，在高溫、高濕條件下，病菌可以快速傳播并導(dǎo)致植株發(fā)生病斑、萎蔫或者果實(shí)腐爛。BFB會(huì)給葫蘆科作物的生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道，在一些商品西瓜地BFB的發(fā)生可導(dǎo)致西瓜減產(chǎn)50% ～90%以上［3，4］。而在我國，2002年冬季海南西瓜育苗場因BFB的爆發(fā)，造成毀苗率達(dá)到30%～80%；同年，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)6師103團(tuán)將甜瓜種植面積由原來的2 000多hm2銳縮減至200多 hm2，原因就是BFB的連年影響［5］。西瓜食酸菌為革蘭氏陰性、棒狀細(xì)菌，嚴(yán)格好氧［6］。種內(nèi)群體結(jié)構(gòu)、寄主范圍和致病性存在著豐富的多樣性［6］，目前研究發(fā)現(xiàn)，西瓜食酸菌種內(nèi)至少存在兩個(gè)亞群，即亞群Ⅰ和亞群Ⅱ，其中亞群Ⅰ的菌株主要分離自非西瓜的葫蘆科作物，亞群Ⅱ的菌株主要來自爆發(fā)BFB的西瓜；亞群Ⅰ的菌株可以溫和侵染較廣范圍的葫蘆科寄主植物；亞群Ⅱ的菌株表現(xiàn)出對(duì)西瓜較強(qiáng)的侵染力，對(duì)其它葫蘆科作物侵染較溫和，且亞群Ⅰ的菌株多數(shù)表現(xiàn)抗銅性。因此，當(dāng)前種子處理的局限性、現(xiàn)有以含銅藥劑為主的殺菌劑防控BFB的無效性［7－11］加上仍未開發(fā)出抗 BFB的商業(yè)品種，BFB已經(jīng)成為全球葫蘆科作物產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重威脅［12］。迄今為止，世界范圍內(nèi)針對(duì) BFB病菌致病的生物學(xué)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)的認(rèn)知非常有限。研究BFB病菌與寄主互作的分子機(jī)理，是開發(fā)有效控制 BFB新途徑、新方法的基礎(chǔ)。酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two hybrid system）是研究蛋白質(zhì)相互作用的方法之一，可以在活體酵母中研究蛋白的相互作用，并用于發(fā)現(xiàn)蛋白的新功能及新蛋白［13－16］。而構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA文庫是利用酵母雙雜交系統(tǒng)大規(guī)模篩選互作蛋白的基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，已有眾多學(xué)者構(gòu)建植物cDNA文庫，及利用該文庫來篩選性狀相關(guān)的重要基因。王麗娟等［17］構(gòu)建了霜霉菌侵染的黃瓜葉片cDNA文庫并進(jìn)行了基因表達(dá)的分析，拼接出427條與植物抗病相關(guān)的基因；劉嚴(yán)等［18］構(gòu)建了白粉菌誘導(dǎo)的番茄葉片 AD－cDNA文庫，并對(duì)文庫進(jìn)行了初步的分析。薛璞［19］構(gòu)建柔嫩艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫并且初步篩選了 EtAMA1相互作用蛋白；林振［20］構(gòu)建了乳鼠成骨細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫并且篩選與CITED1相互作用蛋白；宋林霞［21］利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與G蛋白及 CaM相互作用的新蛋白。西瓜食酸菌侵染寄主的致病機(jī)制研究仍處于起步階段，數(shù)個(gè)國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)分別以西瓜食酸菌-西瓜或者西瓜食酸菌-甜瓜互作的模式探索 BFB的分子基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了一些與致病相關(guān)的因子，如lysR、luxI、HrcN及T3SS分泌系統(tǒng)等［22－29］；黃瓜（Cucumis sativus L.）為葫蘆科甜瓜屬植物，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，具有悠久的栽培歷史，在我國的蔬菜生產(chǎn)中占有重要地位，且黃瓜是唯一已經(jīng)完成全基因組測序的葫蘆科植物（GenBank登錄ACHR01000000）［30］，使其成為葫蘆科植物生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的模式材料，包括作為研究病原菌 －寄主植物互作的模式植物材料?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì) BFB病菌與其寄主互作的分子機(jī)制的研究仍處于起始階段，有關(guān)BFB病菌侵染寄主材料的cDNA文庫構(gòu)建方面的研究還未見報(bào)道。研究以接種細(xì)菌性果斑病菌4 d的Chinese long品種自交系“9930”黃瓜子葉為材料，分離純化 mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，利用同源重組的方法將雙鏈cDNA轉(zhuǎn)移到酵母雙雜交載體pGADT7中，達(dá)到構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量cDNA文庫的目的。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究以 BFB病菌與黃瓜互作體系為材料，構(gòu)建一個(gè)高質(zhì)量的BFB病菌侵染初期的黃瓜材料的cDNA文庫，為開展 BFB病菌致病寄主植物的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試黃瓜（Cucumis sativus L.）為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)的Chinese long品種自交系9930；供試西瓜食酸菌為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)胡白石教授惠贈(zèng)的FC440菌株，該菌株屬于亞群Ⅰ、分離自新疆發(fā)病的甜瓜。

植物材料的培養(yǎng)［31］如下：黃瓜種子經(jīng)1%（w／v）NaClO消毒10min后，蒸餾水充分漂洗3次，再于55℃溫水中處理20min，然后使用標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)高壓蒸汽滅菌的盆栽土壤在25°C，16h／8h光暗交替的培養(yǎng)室中培養(yǎng)至6d齡的子葉。接種后的植物材料放置于大于95%濕度（盆栽器皿覆膜并扎孔通氣）的上述生長條件下至所需天數(shù)。

西瓜食酸菌FC440接種于含30 μg／mL Amp的KMB固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h后挑取單菌落接種于NB液體培養(yǎng)基進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌液于1000g離心10 min，菌體以無菌 ddH2O配置成OD600為0.5的細(xì)胞懸液，此時(shí)細(xì)菌濃度約為9.68×108cfu／mL［32］。用滅菌的棉簽將上述菌液涂抹于6d齡黃瓜幼苗子葉表面。25℃，16h／8h光暗交替培養(yǎng)4 d后摘取接種的子葉，立即置于液氮中速凍，然后置于－70℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

研究中所使用的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 方 法

1.2.1 總 RNA的提取

以西瓜食酸菌FC440菌株處理過的黃瓜幼苗子葉為建庫材料，提取黃瓜子葉的總RNA，具體操作步驟按照Trizol試劑（Invitrogen）的說明書進(jìn)行。利用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的OD值和濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。

1.2.2 mRNA的分離

使用 Oligotex mRNA Kits（Qiagen）分離純化mRNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質(zhì)量。

1.2.3 cDNA的合成

利用分離純化后的 mRNA為模板，以3’RT Primer和RT酶，合成 cDNA第一鏈，合成反應(yīng)體系中3’RT－Primer、dNTPs終濃度分別為 1.5 pmol／L和200 μmol／L，RT酶（Invitrogen）為1 000 U，10 mmol／L DTT，50℃反應(yīng)60 min。再以第一鏈cDNA為模板，加入E．coli.DNA Ligase10U、E．coli．DNA Polymerase I 40U、E．coli.RNaseH 2U（Invitrogen）于 16℃反應(yīng)2 h生成雙鏈cDNA，再加入T4DNA Polymerase 10U于16℃反應(yīng)5 min產(chǎn)生cDNA平末端，之后反應(yīng)體系中加入0.5 M EDTA（pH 8.0）10 μL，混合均勻后加入等體積的酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1）進(jìn)行抽提，最后經(jīng)乙醇沉淀的雙鏈 cDNA溶于 DEPC處理的 ddH2O中。雙鏈cDNA加5’接頭的反應(yīng)通過6U的T4DNA Ligase（Invitrogen）與 4 μg的 5’Adapter混勻后在16℃下反應(yīng)16～24 h完成。使用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳cDNA，切膠回收1 kb以上的條帶，乙醇沉淀后溶于14 μL水中。膠回收具體步驟參照Axygen公司的膠回收試劑盒說明書。

1.2.4 同源重組構(gòu)建cDNA文庫

取上述分離后的cDNA與載體pGADT7利用Infusion enzyme mix（Invitrogen）在20 μL的反應(yīng)體系中于50℃反應(yīng)30 min進(jìn)行同源重組，重組產(chǎn)物經(jīng)2 μL Proteinase K在37℃處理15 min及75℃處理10 min后，再依次加入1 μL Glycogen（20 μg／μL）、50 μL的7.5 M NH4OAc和375 μL的無水乙醇，混合均勻后置于 －80℃至少1 h，4℃下16 000 r／m離心30 min后去除上清，以70%乙醇清洗cDNA沉淀，用10 μL的 DEPC水重懸沉淀。然后電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入 SOC培養(yǎng)基中，置于37℃，100～120 r／m培養(yǎng)至少1 h，培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物稀釋10，100，1 000和10 000倍，分別取10 μL稀釋液涂布于含30 μg／mL Amp的 LB平板上，剩余培養(yǎng)物加入終濃度 20%甘油后保存于 －80℃超低溫冰箱，即為cDNA文庫菌液。

1.2.5 cDNA文庫的庫容量和插入片段大小的測定

取轉(zhuǎn)化后酵母菌液10 μL稀釋100倍后，從中取出10 μL涂布含30 μg／mL Amp的 LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，做兩次重復(fù)，第二天統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)，庫容量（cfu）＝平板上的克隆數(shù)／10 μL×稀釋倍數(shù)×103μL×文庫菌液總體積（mL）。在平板上隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆懸浮于 20 μL ddH2O中做模板，使用的引物為 JC－F／JC－R。PCR反應(yīng)體系中MgCl2、dNTP終濃度分別為2 mmol／L和200 μmol／L引物 JC－F／JC－R（10μM）終濃度為 500 μmol／L，Taq酶（TaKaRa）2.5 U。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性 30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，確定插入片段的大小及文庫的重組率。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取和 mRNA的分離純化

利用Trizol試劑提取黃瓜葉片的總RNA，使用Oligotex mRNA Kits分離純化樣本的mRNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性，凝膠成像系統(tǒng)顯示，有28S、18S、5S核糖體RNA 3條特異性條帶，并且28S條帶的亮度約為18S的2倍，不存在 明 顯 的降解現(xiàn) 象。經(jīng) 測 定，OD260／OD280＝2.03，濃度為450 ng／μL；分離純化的 mRNA電泳條帶呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，mRNA總量為5.1 μg。結(jié)果表明，所提取的總 RNA和分離純化的 mRNA的含量較高，純度較好，并且沒有降解現(xiàn)象，質(zhì)量完全符合構(gòu)建文庫的需要。圖1

圖1 細(xì)菌性果斑病菌侵染初期的黃瓜子葉總RNA和 mRNA的凝膠電泳檢測Fig．1 Gel electrophoresis analysis of total RNA and mRNA from cotyledons of cucumber infected by Acidovorax citrμlli

2.2 cDNA的質(zhì)量

以分離純化的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再以第一鏈為模板合成雙鏈cDNA。研究表明，得到的雙鏈cDNA電泳條帶呈彌散狀均勻分布，說明總RNA降解較少，大小分布在 850～4 000 bp，說明不同大小和不同豐度的mRNA都得到了有效的反轉(zhuǎn)錄，所合成的雙鏈cDNA可以用來構(gòu)建cDNA文庫。圖2

圖2 雙鏈cDNA凝膠電泳檢測Fig．2 Gel electrophoresis analysis of double－strand cDNA

2.3 cDNA文庫的質(zhì)量鑒定

將10 μL文庫與載體pGADT7同源重組后電轉(zhuǎn)化菌液稀釋100倍，取 10 μL涂布于含 30 μg／mL Amp的 LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，共長了約220個(gè)克隆子，根據(jù)公式計(jì)算得受侵染黃瓜子葉cDNA文庫的滴度為 2.2×106CFU／mL，總共 5mL的轉(zhuǎn)化后原始菌液，則庫容量為 1.1×107CFU。隨機(jī)挑取24個(gè)酵母單克隆做菌落PCR，鑒定插入cDNA片段的大小，可以看出，在24個(gè)克隆中僅有一個(gè)單克隆沒有轉(zhuǎn)化成功，計(jì)算得該文庫重組率為95.8%；從電泳圖來看，平均插入片段的大小在1.5 kb左右。結(jié)果表明，所構(gòu)建的黃瓜子葉cDNA文庫的庫容量和質(zhì)量均達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫的要求，并且保證了cDNA的完整性。圖3，圖4

圖3 重組于pGADT7的cDNA片段電轉(zhuǎn)化后的平板Fig．3 The flat plate electrically transformed from the cDNA fragment of the pGADT7 fragment

圖4 文庫隨機(jī)菌落PCR電泳檢測Fig．4 Electrophoretogram of PCR products of random colones from the library

3 討 論

構(gòu)建cDNA文庫的完整性及基因的種類和豐度取決于所提取的總RNA濃度與純度的高低［33］，所以RNA的提取極其重要。研究采用Trizol法提取受西瓜食酸菌侵染的黃瓜子葉總RNA，在提取過程始終遵循高濃度，高純度的原則。在凝膠電泳時(shí)可以看到28S、18S、5S三條特異性條帶，并且分離提純的mRNA電泳后呈彌散性條帶，說明所提取的總RNA以及分離提純的mRNA的質(zhì)量完全符合構(gòu)建文庫的標(biāo)準(zhǔn)；利用E．coli.DNA Ligase、E．coli．DNA Polymerase I、E．coli. RNaseH三種酶共同作用合成cDNA的第二鏈，得到較高質(zhì)量的雙鏈cDNA，并采用同源重組的方法，將雙鏈cDNA轉(zhuǎn)至載體 pGADT7，獲得酵母雙雜交cDNA文庫，與SMART方法相比，沒有任何PCR過程的參與，這保證了文庫中cDNA序列的盡量完整，而且不受限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的制約，同時(shí)還具有快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)。

cDNA文庫的質(zhì)量對(duì)于篩選與功能蛋白相互作用的蛋白至關(guān)重要，鑒定cDNA文庫質(zhì)量的好壞主要從文庫的庫容量、文庫的重組率及插入片段的大小等方面評(píng)判［34］。cDNA文庫的庫容量表示構(gòu)建的cDNA文庫中包含的轉(zhuǎn)化后的克隆子數(shù)，根據(jù)Sambrook等［35］的研究表明一個(gè)良好的cDNA文庫要求文庫的庫容量至少為1.7×105CFU／mL，如果文庫的庫容量過低，則文庫所包含的基因信息就不全面，從而篩選到低豐度基因的概率就降低了。研究所構(gòu)建的黃瓜葉片cDNA文庫的庫容量為2.2×106CFU／mL，總庫容量為1.1 ×107CFU；cDNA文庫的重組率為95.8%，隨機(jī)選取的24個(gè)單克隆平均插入片段長度為1.5 kb左右，由此說明達(dá)到了高質(zhì)量文庫的要求，可以利用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模篩選西瓜食酸菌與黃瓜的互作蛋白，進(jìn)而去解析西瓜食酸菌導(dǎo)致寄主黃瓜發(fā)病的機(jī)制。

楊成君等［36］總結(jié)了cDNA文庫的應(yīng)用，可用于篩選與性狀相關(guān)的的重要基因及獲得目的基因的全長cDNA，可以為表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）的開發(fā)提供材料，發(fā)現(xiàn)植物與病原菌互作的因子，為研究植物與細(xì)菌性果斑病互作分子機(jī)理提供基礎(chǔ)；可以用于構(gòu)建消減cDNA文庫，克隆特意表達(dá)基因；為SSR引物的開發(fā)提供平臺(tái)等。劉曉東等［37］將cDNA文庫應(yīng)用于植物的抗蟲研究中，郭新紅等［38］將cDNA文庫應(yīng)用于植物抗逆境分子機(jī)理的研究中。研究構(gòu)建的細(xì)菌性果斑病菌誘導(dǎo)黃瓜子葉cDNA文庫使試驗(yàn)也具備了能夠開展與上述研究工作相似內(nèi)容的條件。

4 結(jié) 論

利用Trizol試劑提取的黃瓜子葉總RNA電泳檢測出3條特異性條帶，分離純化的mRNA與反轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA電泳檢測呈彌散條帶，雙鏈cDNA大小分布在850～4 000 bp，獲得的雙鏈cDNA質(zhì)量較高，可用于文庫的構(gòu)建。通過同源重組的方法獲得受細(xì)菌性果斑病菌侵染的黃瓜子葉cDNA文庫，庫容量達(dá)2.2×106CFU／mL，文庫重組率為95.8%，文庫插入片段的平均長度在1.5 kb左右。所構(gòu)建的黃瓜子葉細(xì)菌性果斑病菌侵染初期的cDNA文庫質(zhì)量較高，可以用于進(jìn)行與功能蛋白相互作用的篩選。

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Construction and Evaluation of cDNA Library from Cotyledon of Cucumber Challenged by Acidovorax citrulli

HU Jin－feng，LIU Jun
（College of Forestry and Horticulture，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

【Objective】To study the mechanism of interaction between Acidovorax citrulli and its hostcucumber（Cucumis sativus L.），a cDNA library was constructed from the cotyledon of the cucumber challenged by the bacteria.【Method】Using 4 DPI cotyledon of＇Chinese long＇inbred line 9930 of cucumber，the mRNA was isolated and purified，and reverse transcribed into double stranded cDNA.Through the homologous recombination，the double stranded cDNA was recombined into the pGADT7 vector of yeast two－h(huán)ybrid system The quality of the library was analyzed and evaluated.【Result】Electrophoresis detection showed that a high quality of total RNA，mRNA and ds－cDNA had been extracted from infected cotyledons of cucumber；The titer of the constructed cDNA library was 1.1×107CFU，and the recombination rate of the library was about 95.8%，the average length of the insert fragments in the library was about 1.5 kb，up to the standard cDNA library requirements.【Conclusion】The analysis showed that the constructed cDNA libraries were with high quality，and can be used for screening functional proteins in interaction process between Acidovorax citrμlli and its host.

Acidovorax citrulli；cotyledon of Cucumis sativus L.；homologous recombination；yeast two－h(huán)ybrid cDNA library

S436.431.1

A

1001－4330（2016）09－1625－08

10.6048／j.issn.1001－4330.2016.09.008

2016－04－26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260419）

胡金鳳（1990－），女，重慶銅梁人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)，（E－mail）hujinfeng137＠126.com

（Cotresponding author）：劉君（1970－），女，湖北麻城人，副教授，研究方向?yàn)橹参锊≡?xì)菌致病機(jī)制，（E－mail）liujem＠126. com

Fund project：The National Natural Science Foundation of China（31260419）