不同地理種群馬鈴薯甲蟲SSR、RAPD遺傳多樣性分析

劉 旸，付開赟，吐爾遜·阿合買提，何 江，郭文超，周 俊

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091）

不同地理種群馬鈴薯甲蟲SSR、RAPD遺傳多樣性分析

劉 旸1，付開赟2，吐爾遜·阿合買提2，何 江2，郭文超2，周 俊3

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091）

【目的】對(duì)哈薩克斯坦共和國(guó)毗鄰的中國(guó)新疆伊犁河谷地區(qū)馬鈴薯甲蟲發(fā)生區(qū)進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究不同地理種群的遺傳分化狀況，反演發(fā)生區(qū)馬鈴薯甲蟲的傳播路徑。【方法】利用SSR、RAPD分子標(biāo)記方法對(duì)不同地理種群的馬鈴薯甲蟲進(jìn)行遺傳多樣性分析。【結(jié)果】通過(guò)篩選8對(duì)有效引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增得到的Shannon’s信息指數(shù)和平均基因多樣性分別為（1.422 6±0.396 7）和（0.543 8±0.083 5），Nei＇s基因分化系數(shù)Fst為 0.206 8，即20.68%、79.32%的遺傳變異存在于種群內(nèi)。運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記方法擴(kuò)增出28個(gè)條帶，其中特異性條帶14個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為50%，Shannon’s信息指數(shù)和平均基因多樣性為（0.215 9±0.129 2）和（0.113 8±0.084 2），RAPD分子標(biāo)記得出的Gst值為0.163 7，即16.37%的遺傳變異存在于種群間，83.67%的遺傳多樣性存在于種群內(nèi)。運(yùn)用UPGMA聚類分析得知SSR分子標(biāo)記方法中，中國(guó)東北與西北地區(qū)分為兩支，烏昌地區(qū)與塔城地區(qū)聚類；RAPD聚類分析得到的結(jié)果與SSR基本一致，個(gè)別地理種群聚類結(jié)果與地理位置存在一定偏差。【結(jié)論】SSR分子標(biāo)記方法重復(fù)性好且較為高效，供試馬鈴薯甲蟲樣本遺傳變異性較低，RAPD方法與SSR方法研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了馬鈴薯甲蟲在中國(guó)新疆的傳播路徑，即馬鈴薯甲蟲從哈薩克斯坦共和國(guó)的塔爾巴哈臺(tái)地區(qū)傳入中國(guó)新疆塔城市，之后沿天山北坡逐步向東擴(kuò)散。

馬鈴薯甲蟲；SSR；RAPD；遺傳多樣性

0 引 言

【研究意義】馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata Say），隸屬于鞘翅目，葉甲科［1］，是國(guó)際公認(rèn)的馬鈴薯毀滅性檢疫害蟲，1855年首次報(bào)道了馬鈴薯甲蟲在美國(guó)科羅拉多州馬鈴薯產(chǎn)區(qū)造成嚴(yán)重危害［2］。馬鈴薯甲蟲傳入中國(guó)后，20多年來(lái)自西向東傳播，目前已在新疆北部大部分地區(qū)均有分布，且近幾年馬鈴薯甲蟲擴(kuò)散加快、危害加重。為了開發(fā)合適和有效的綜合防治策略，應(yīng)進(jìn)一步研究其空間分布和入侵規(guī)律，利用分子遺傳多樣性分析可以很好解決這一問(wèn)題［3］。【前人研究進(jìn)展】很多學(xué)者已開展了大量關(guān)于遺傳多樣性的研究。高偉［4］、劉志敏等［5］運(yùn)用SSR（simple sequence repeat）方法分別對(duì)四倍體棉的多態(tài)性及大麥種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在棉花中，陸地棉與陸地棉野生種系中闊葉棉的親緣關(guān)系最近；國(guó)內(nèi)外大麥育種均存在遺傳基礎(chǔ)較窄的問(wèn)題，需加強(qiáng)外來(lái)種質(zhì)的引進(jìn)與利用。在馬鈴薯甲蟲的相關(guān)研究中，張潤(rùn)志等［3］利用SSR分子標(biāo)記對(duì)新疆馬鈴薯甲蟲遺傳多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)新疆發(fā)生區(qū)的馬鈴薯甲蟲種群遺傳多樣性較低。運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性的研究也有報(bào)道，如張迎春［6］、楊子祥等［7］利用RAPD（random amplified polymorphic DNA）技術(shù)分別對(duì)6種瓢蟲分類、倍蚜種間親緣關(guān)系及角倍蚜種群分化進(jìn)行了研究，認(rèn)為6種瓢蟲種、屬之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致；Sidorenko［8］等運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記對(duì)馬鈴薯甲蟲多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)同一地點(diǎn)采集的馬鈴薯甲蟲春季代多態(tài)性遠(yuǎn)高于夏季代。這些研究運(yùn)用SSR和RAPD分子標(biāo)記方法對(duì)植物與昆蟲的遺傳多樣性進(jìn)行分析，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)馬鈴薯甲蟲的遺傳多樣性研究尚處在起步階段，仍在使用早期的分子標(biāo)記方法RAPD，此方法穩(wěn)定性、重復(fù)性較差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠可靠。因此，運(yùn)用不同分子標(biāo)記方法對(duì)馬鈴薯甲蟲的遺傳多樣性進(jìn)行研究，篩選出高效且更適于馬鈴薯甲蟲的分子標(biāo)記方法十分必要。【本研究切入點(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)運(yùn)用不同分子標(biāo)記方法分析馬鈴薯甲蟲遺傳多樣性并篩選出較適合此研究的分子標(biāo)記方法的相關(guān)研究報(bào)道較少。應(yīng)用SSR、RAPD分子標(biāo)記方法對(duì)不同地理種群的馬鈴薯甲蟲進(jìn)行遺傳多樣性分析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】反演馬鈴薯甲蟲在中國(guó)發(fā)生區(qū)傳播路徑，探索其傳播擴(kuò)散規(guī)律，為有效控制馬鈴薯甲蟲的危害，阻止或延緩其進(jìn)一步擴(kuò)散提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

RAPD與SSR分子標(biāo)記所用的馬鈴薯甲蟲樣品于2014年5至8月間采集于新疆馬鈴薯甲蟲發(fā)生區(qū)伊犁河谷地區(qū)、塔城地區(qū)、阿勒泰地區(qū)、昌吉回族自治州、烏魯木齊等6個(gè)地州16個(gè)縣市以及哈薩克斯坦塔爾迪庫(kù)爾汗州、我國(guó)黑龍江省東寧市（與俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)伏拉迪斯沃托克接壤），共采集1 337份標(biāo)本，用于SSR、RAPD遺傳多樣性研究。表1

表1 供試馬鈴薯甲蟲來(lái)源信息Table 1 The specimens tested of Leptinotarsa decemlineata

1.2 方 法

1.2.1 馬鈴薯甲蟲DNA的提取

馬鈴薯甲蟲基因組DNA的提取參考 DNA提取試劑盒（天根）提供的方法，勻漿馬鈴薯甲蟲頭部，10 000 r／min離心1 min，去上清，加200 μL緩沖液 GA，振蕩至徹底懸浮。加入20 μL蛋白酶 K溶液，混勻。加入200 μL緩沖液 GB，混勻，70℃孵育10 min。加人200 μL無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻。轉(zhuǎn)移溶液和絮狀沉淀至吸附柱中，12 000 r／min離心30 s，棄廢液。加入 500 μL緩沖液 GD，12 000 r／min離心30 s，棄廢液。加入600 μL漂洗液 PW，12 000 r／min離心30 s，棄廢液。重復(fù)漂洗一次。12 000 r／min空離 2 min。室溫放置數(shù)分鐘，晾干。加入50～200 μL TE緩沖液，室溫放置2 min，12 000 r／min離心2 min，將溶液收集到離心管中 －20℃保存。

1.2.2 SSR與RAPD分子標(biāo)記

1.2.2.1 SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系及條件

利用11對(duì)熒光標(biāo)記引物，在退火溫度為55℃時(shí)對(duì)20個(gè)地理種群的馬鈴薯甲蟲樣品進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：20 μL，包括7 μL ddH2O，10 μL Premix Taq（北京奧賽博），1 μL模板DNA，各1 μL上下游引物（金唯智）。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)：95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃下延伸40 s，循環(huán)結(jié)束后于72℃條件下完全延伸5 min，取1 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳（北京市六一儀器廠）。表2

表2 SSR分子標(biāo)記引物序列Table 2 SSR primer sequences

1.2.2.2 RAPD分子標(biāo)記反應(yīng)體系及條件

用3條隨機(jī)引物（Biomed）對(duì)15個(gè)地理種群馬鈴薯甲蟲樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。RAPD反應(yīng)體系為25 μL，其中包括10.5 μL ddH2O，12.5 μL 2xTaq PCR Master Mix（Cwbio），1 μL模板DNA，1 μL引物。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5 min；3個(gè)循環(huán)：94℃變性 1 min，45℃退火1.5 min，72℃下延伸2 min。隨后進(jìn)行第二次循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)：94℃變性 1 min，40℃1.5 min，72℃延伸 2 min。循環(huán)結(jié)束后于72℃條件下完全延伸 9 min。PCR產(chǎn)物用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，染料為GoldView I型核酸染色劑（Zomanbio），Marker為DL2000（Cwbio），電泳條件為100 V，45 min，隨后在 Image Lab凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

RAPD與 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物中的每一條帶均視為一個(gè)分子標(biāo)記，有擴(kuò)增條帶記為1，無(wú)擴(kuò)增條帶記為0，建立0，1矩陣。采用POPGEEN 32對(duì)馬鈴薯甲蟲樣本各地理種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，包括每個(gè)地理種群的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)N、每個(gè)位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)Na和有效平均等位基因數(shù)Ne、Nei＇s基因多樣性指數(shù) H、Shannon＇s多樣性信息指數(shù)I，種群總遺傳多樣性系數(shù)（Ht）和地理種群內(nèi)的遺傳變異Hs，地理種群遺傳分化系數(shù)Gst，Nei＇s遺傳距離D和遺傳一致度I，基因流Nm。再用UPGMA方法對(duì)不同地理種群馬鈴薯甲蟲進(jìn)行聚類分析，明確各地理種群之間的遺傳關(guān)系［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR和 RAPD分子標(biāo)記引物篩選結(jié)果

用11對(duì)熒光引物對(duì)部分地理種群樣品進(jìn)行SSR擴(kuò)增，篩選出8對(duì)高效引物：LdA11b、LdB8b、LdE10e、LdE11c、LdAC5－22、LdGA4－5、LdGA5－30，用于后續(xù) 20個(gè)地理種群馬鈴薯甲蟲SSR擴(kuò)增。運(yùn)用RAPD方法從3個(gè)引物中篩選出條帶清晰且多態(tài)性高的引物，擴(kuò)增獲得28個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶14個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）為50%，說(shuō)明所檢測(cè)的條帶多態(tài)性較低。圖1

圖1 P4引物對(duì)部分地理種群擴(kuò)增RAPD帶型Fig．1 Part of RAPD bands of partal population samples

2.2 SSR、RAPD分子標(biāo)記對(duì)馬鈴薯甲蟲不同地理種群遺傳多樣性進(jìn)行分析

采用 SSR分子標(biāo)記方法對(duì)供試的馬鈴薯甲蟲遺傳多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明：馬鈴薯甲蟲在物種水平上，等位基因數(shù)（Na）為8.250 0個(gè)，有效等位基因數(shù)（Ne）為 3.555 2個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為100%。不同地理種群水平上的等位基因數(shù)（Na）為2.375 0～4.250 0（察布察爾－木壘）個(gè)，平均為3.218 75個(gè)，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.898 6～3.316 9（察布察爾 －博樂(lè)）個(gè)，平均為2.510 0個(gè)；多態(tài)位點(diǎn)百分率在75% ～100%（呼圖壁 －黑龍江），平均為 97.5%。各地理種群的Nei＇s期望雜合度在 0.412 5～0.655 0（察布察爾－博樂(lè)），平均為0.543 8；Shannon＇s信息多樣性指數(shù)（I）0.659 7～1.223 8（察布察爾－木壘），平均為0.950 5。運(yùn)用POPGENE軟件分析可知由SSR方法獲得的不同地理種群總的近交系數(shù) Fis＝0.124 1，地理種群之間的基因分化系數(shù)Fst＝0.206 8，種群間基因流Nm ＝0.958 8。表3

采用RAPD分子標(biāo)記方法對(duì)不同地理種馬鈴薯甲蟲的遺傳多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明：供試的不同地理種群水平上，等位基因（Na）為1.214 3～1.607 1（博樂(lè) －尼勒克）個(gè)，平均值為1.407 1，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.083 5～1.199 9（博樂(lè) －瑪納斯）個(gè)，平均為1.138 5個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率在21.43%～60.71%（博州 －尼勒克），平均為40.72%，各地理種群的 Nei＇s基因多樣性指數(shù)在0.056 1～0.121 6（博樂(lè) －瑪納斯），平均為0.096 2，Shannon＇s信息多樣性指數(shù)（I）0.090 7～0.193 5（博樂(lè) －奇臺(tái)），平均為0.159 4；從整體物種水平上來(lái)看，等位基因數(shù)（Na）為2.000 0個(gè)，有效等位基因數(shù)為1.139 1個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為89.3%，Nei＇s遺傳多樣性指數(shù)（H）為0.113 8，Shannon＇s信息多樣性指數(shù)（I）為（0.215 9±0.129 2）。兩個(gè)代表遺傳多樣性大小的指數(shù)（I，H）均較小，表明所采集到的地理種群遺傳多樣性均較低。RAPD方法獲得的總基因多樣性（Ht）值、種群內(nèi)基因多樣（Hs）、基因分化系數(shù)（Gst）、基因流（Nm）分別為：（0.115 0±0.007 2）、（0.096 2± 0.004 4）、（0.163 7、2.554 4），即16.37%的遺傳變異發(fā)生在各個(gè)種群之間，83.63%的遺傳變異發(fā)生在種群內(nèi)部。說(shuō)明種群間的遺傳分化程度較低，發(fā)現(xiàn)與SSR方法中所得結(jié)論基本一致。表4

2.3 SSR、RAPD分子標(biāo)記方法對(duì)不同地理種群馬鈴薯甲蟲的聚類分析

RAPD分子標(biāo)記分析得出馬鈴薯甲蟲 15個(gè)地理種群間的遺傳距離，馬鈴薯甲蟲15個(gè)種群的遺傳相似度范圍為 0.882 3～0.987 4，遺傳距離指數(shù)范圍為0.012 7～0.125 2，阿勒泰種群與察布查爾種群間遺傳距離最近，為 0.012 7，其次是察布查爾種群和額敏種群，為 0.015 2，遺傳距離最大的為博樂(lè)種群與霍城種群，為0.125 2。RAPD的遺傳多樣性分析表明，位于北疆發(fā)生區(qū)的烏魯木齊等縣市的種群均與塔城方向的額敏，博州溫泉縣等縣市地區(qū)遺傳距離最近。表5，圖2

SSR分子標(biāo)記方法通過(guò)運(yùn)用 POPGEN 32軟件分析馬鈴薯甲蟲20個(gè)地理種群間的遺傳距離，馬鈴薯甲蟲 20個(gè)種群的遺傳相似度范圍為0.451 6～0.887 3，遺傳距離指數(shù)范圍為0.119 6～0.779 3，其中塔城種群與額敏種群間遺傳距離最近，為 0.119 6，遺傳距離最大的為察布查爾種群與木壘種群，為0.779 3。通過(guò)對(duì)上述遺傳距離的分析，構(gòu)建了SSR不同地理種群聚類分析圖譜。圖中東北地區(qū)與西北地區(qū)分為兩支，中國(guó)新疆奇臺(tái)、木壘、瑪納斯、呼圖壁、阜康、烏魯木齊縣種群聚為一支，哈薩克斯坦與中國(guó)新疆額敏、博州的分支最近。表6，圖3

表3 運(yùn)用 SSR分子標(biāo)記分析馬鈴薯甲蟲不同地理種群遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of Leptinotarsa decemlineata popμlations

表4 運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記分析馬鈴薯甲蟲不同地理種群遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of Leptinotarsa decemlineata popμlations

圖2 RAPD分子標(biāo)記對(duì)15個(gè)馬鈴薯甲蟲地理種群 UPGMA聚類圖Fig．2 Thedendrogram Based Nei＇s（1978）Genetic distance for Leptinotarsa decemlineata using RAPD

圖3 SSR分子標(biāo)記對(duì)20個(gè)馬鈴薯甲蟲地理種群聚類圖Fig．3 The dendrogram Based Nei＇s（1978）Genetic distance for Leptinotarsa decemlineata using SSR

表5 RAPD分子標(biāo)記15個(gè)種群間的遺傳距離指數(shù)（下三角）與遺傳相似度（上三角）Table 5 Genetic distance（above diagonal）and Nei＇s genetic identity（below diagonal）

表6 SSR分子標(biāo)記20個(gè)種群間的遺傳距離指數(shù)（下三角）與遺傳相似度（上三角）Table 6 Nei's genetic identity (above diagonal) and genetic distanee (below diagonal)

3 討 論

3.1 就分子標(biāo)記技術(shù)本身而言，由于多態(tài)性產(chǎn)生的機(jī)制不同，SSR多態(tài)性產(chǎn)生的機(jī)率大于RAPD，使SSR分子標(biāo)記具有高度多態(tài)性和高信息量的特點(diǎn)［9－10］。RAPD分子標(biāo)記盡管較易受到各種因素的影響，其重復(fù)性較差，有一定的局限性［11］，但技術(shù)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高，也被廣泛運(yùn)用［12－13］。研究中對(duì) SSR及RAPD方法進(jìn)行了比較，最終發(fā)現(xiàn)SSR分子標(biāo)記較為穩(wěn)定，得到的多態(tài)性條帶較多、信息量較大、研究結(jié)果較為可靠。

3.2 馬鈴薯甲蟲是馬鈴薯毀滅性檢疫害蟲，其飛行能力強(qiáng)，在新疆北疆地區(qū)大范圍分布，主要通過(guò)幼蟲和成蟲取食寄主莖葉對(duì)馬鈴薯等茄科植物造成嚴(yán)重為害［14－15］。1993年 5～7月馬鈴薯甲蟲由境外入侵中國(guó)新疆伊犁河谷地區(qū)與塔城地區(qū)［2］，伊犁河谷地區(qū)三面環(huán)山，其東部受到天山南支（平均海拔3 000 m）和北支（平均海拔2 500 m）的共同阻隔，使得 20多年來(lái)馬鈴薯甲蟲在該區(qū)域無(wú)法繼續(xù)向東擴(kuò)散；而塔城以東地區(qū)地勢(shì)平坦，馬鈴薯甲蟲可以沿天山北坡無(wú)高山阻隔的綠洲和荒漠進(jìn)行傳播，因此，這種特殊的地理和氣候條件使其更加容易從塔城地區(qū)沿天山北坡逐步向東傳播擴(kuò)散。

4 結(jié) 論

4.1 研究比較了SSR、RAPD兩種分子標(biāo)記方法，發(fā)現(xiàn)SSR分析標(biāo)記具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好的特點(diǎn)，是較為高效且更適于馬鈴薯甲蟲遺傳多樣性研究的分子標(biāo)記法。

4.2 通過(guò) UPGMA聚類分析可知，黑龍江省東寧市種群（來(lái)源于俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)伏拉迪斯沃托克）與哈薩克斯坦及中國(guó)新疆發(fā)生區(qū)各地理種群明顯分為兩支，而哈薩克斯坦種群與中國(guó)新疆塔城地區(qū)種群聚為一支且與中國(guó)額敏、博州種群分支最近，烏昌地區(qū)與塔城地區(qū)種群聚類，結(jié)合實(shí)際入侵路徑的寄主生境和傳播過(guò)程中的高山屏障作用，推斷馬鈴薯甲蟲從哈薩克斯坦的塔爾巴哈臺(tái)地區(qū)入侵中國(guó)新疆塔城市后，沿天山北坡逐步向東進(jìn)一步擴(kuò)散。

（

）

［1］郭文超，吐爾遜，許建軍，等，馬鈴薯甲蟲識(shí)別及其在新疆的分布、傳播和危害［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（5）：906－909. GUO Wen－chao，Tuerxun，XU Jian－jun，et al.（2010）.Research on the Identification of Colorado Potato Beetle＆Its Distribution Dispersal and Damage in Xinjiang［J］.Xinjiang Agricultural Sciences，47（5）：906－909.（in Chinese）

［2］郭文超.重大外來(lái)入侵害蟲馬鈴薯甲蟲生物學(xué)、生態(tài)學(xué)與綜合防控［M］.北京：科學(xué)出版社，2013. GUO Wen－chao.（2013）.The biology，ecology and intergrated control of Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata［M］.Beijing：Science Press.（in Chinese）

［3］Zhang，J.J.，Yang，J.，Li，Y.C.，Liu，N.，＆Zhang，R. Z.（2013）.Genetic relationships of introduced colorado potato beetle leptinotarsa decemlineata，populations in Xinjiang，China. Insect Science，20（5）：643－654.

［4］高偉，劉方，黎紹惠，等.利用SSR分析四倍體棉種多態(tài)性［J］.作物學(xué)報(bào)，2010，36（11）：1 902－1 909. GAO Wei，LIU Fang，LI Shao－h(huán)ui，et al.（2010）.Genetic Diversity of Allotetraploid Cotton Based on SSR Markers［J］.Acta Agronomica，36（11）：1，902－1，909.（in Chinese）

［5］劉志敏，金能，呂超，等.大麥種質(zhì)資源的SSR遺傳多樣性分析［J］.麥類作物學(xué)報(bào)，2011，31（5）：839－846. LIU Zhi－min，JIN Neng，Lü Chao，et al.（2011）.Genetic Diversity Analysis of Barley Varieties by SSR［J］Journal of Tritica Crops，31（5）：839－846.（in Chinese）

［6］張迎春，鄭哲民.6種瓢蟲的RAPD分析及在分類上應(yīng)用的研究［J］.西北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，32（4）：409－412. ZHANG Ying－chun，HENG Zhe－min.（2002）.RAPD analysis and its application to taxonomy of six species of lady beetles［J］.Journal of Northwest University（Natural Science Edition），32（4）：409－412.（in Chinese）

［7］楊子祥，陳曉鳴，馮穎，等.倍蚜種間親緣關(guān)系及角倍蚜種群分化的RAPD分析［J］.林業(yè)科學(xué)，2007，43（7）：44－50. YANG Zi－xiang，CHEN Xiao－ming，F(xiàn)EN Ying，et al.（2007）.RAPD Analysis of Phylogenetic Relationships in Chinese Gallnut Aphids（Homoptera：Pemphigidae）and Genetic Differentiation in Four Populations of Schlechtendalia chinensis［J］. Scientia Silvae Sinicae，43（7）：44－50.（in Chinese）

［8］Sidorenko，A.P.，＆Berezovskaya，O.P.（2001）.Individual polymorphism for rapd markers in spring generation of colorado potato beetle leptinotarsa decemlineata（say）.Russian Journal of Genetics，37（10）：1，130－1，133.

［9］Powell，W.，Morgante，M.，Andre，C.，Hanafey，M.，Vogel，J.，＆Tingey，S.，et al.（1996）.The comparison of rflp，rapd，aflp and ssr（microsatellite）markers for germplasm analysis.Molecular Breeding，2（3）：225－238.

［10］Dan，M.，Meyer，R.，Bradshaw，J.E.，Baird，E.，Bonar，N.，＆Provan，J.，et al.（1997）.Comparison of pcr－basedmarker systems for analysis of genetic relationships in cultivated potato.Molecular Breeding，3（2）：127－136.

［11］姜自鋒，林乃銓，徐梅.RAPD技術(shù)及其應(yīng)用中的一些問(wèn)題［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，31（3）：356－360. JIANG Zi－feng，Lin Nai－quan，XU Mei.（2002）.A revivw on some technical problems in RAPD application［J］.Journal of Fujian Agricultural University，31（3）：356－360.（in Chinese）

［12］李惠英，婁燕宏，胡濤，等.中國(guó)高羊茅種質(zhì)資源遺傳多樣性的 RAPD分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（6）：208－214. LI Hui－ying，LOU Yan－h(huán)ong，HU Tao，et al.（2010）.Genetic diversity analysis of Chinese natural tall fescue（Festuca arundinacea）germplasms by RAPD［J］.Practaculture Science，19（6）：208－214.（in Chinese）

［13］李曉穎，宋長(zhǎng)年，張彥蘋，等.果梅RAPD標(biāo)記不同電泳指紋比較及擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，34（5）：29－33. LI Xiao－ying，CONG Chang－nian，ZHANG Yan－ping et al.（2010）.Comparison of RAPD fingerprints of fruiting mei generated by different electrophoresis and characterization of the amplified sequences［J］.Journal of Nanjing Forestry University，34（5）：29－33.（in Chinese）

［14］吐爾遜·阿合買提，許建軍，郭文超，等.馬鈴薯甲蟲主要生物學(xué)特性及發(fā)生規(guī)律研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（6）：1 147－1 151. Tuerxun，XU Jian－jun，GUO Wen－Chao et al.（2010）. Study on Major Biological Characteristics and Occurrence Regulation of Colorado Potato Beetle［J］.Xinjiang Agricultural Sciences，47（6）：1，147－1，151.（in Chinese）

［15］郭利娜，郭文超，吐爾遜，等.溫度與取食對(duì)越冬后馬鈴薯甲蟲飛行能力的影響［J］.植物保護(hù)，2011，37（5）：56－61. GUO Li－nang，GUO Wen－chao，Tuerxun，et al.（2011）. Effects of temperature and feeding status on flight capacity of overwintering colorado potato beetles［J］.Plant Protection，37（5）：56－61.（in Chinese）

Analysis on Genetic Diversity of Different Geographical Population of the Leptinotarsa decemlineata Using RAPD and SSR Markers

LIU Yang1，F(xiàn)U Kai－yun2，Tuerxun Ahemaiti2，HE Jiang2，GUO Wen－chao2，ZHOU Jun3
（1．College of Agronomy，Shihezhi University，Shihezi Xinjiang 832003，China；2．Research Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091，China；3．Institute of Quality Standards＆Testing Technology for Agro－Products，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi 830091）

【Objective】This experiment carries out the genetic diversity analysis and validates the introduction pathway of Leptinotarsa decemlineata collected from CPB＇s distribution area in China and Kazakhstan area adjacent to Ili river valley.【Method】Utilizing SSR and RAPD to analyze genetic diversity of different geographical populations of Leptinotarsa decemlineata in Xinjiang.【Result】Using 8 SSR primers，average Shannon＇s Information Index and mean gene diversity were（1.422，6±0.396，7）and（0.543，8±0.083，5），respectively.Nei＇s genetic differentiation index is 0.206，8，indicating 20.68%and 79，32%genetic variation originate from within and between the populations.By using RAPD，28 bands were amplified of which 14 were polymorphic，the percentage of polymorphic bands was 50%，average Shannon＇s Information Index and mean gene diversity were（0.215，9±0.129，2）and（0.113，8±0.084，2），Nei＇sgenetic differentiation index was 0.163，7，indicating 16.37%and 83.67%of the genetic variation derived from between and within the populations，SSR＇s Nei＇s genetic identity and UPMGA analysis showed Wuchang prefecture clusters with Tarbagatay prefecture.RAPD dendrogram analysis was essentially consistent with SSR，but there was little deviation between dendrogram result and geographical location.【Conclusion】SSR method is comparatively more effective and repeatable than RAPD method in this study.The genetic diversity of CPB population is relative low in testing samples.Both RAPD and SSR＇s dendrogram results validate the propagation path of the Colorado potato beetle in Xinjiang，I.e.the Colorado potato beetle invaded Tacheng，China from Tarbaghatai，Kazakhstan，then further their invasion route to the east region along the north slope of Tianshan mountains.

Leptinotarsa decemlineata；SSR；RAPD；genetic diversity

S435.32

A

1001－4330（2016）09－1608－10

10.6048／j.issn.1001－4330.2016.09.006

2016－03－24

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“生物安全關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)”重點(diǎn)專項(xiàng)“主要入侵生物的動(dòng)態(tài)分布與資源庫(kù)建設(shè)”（2016YFC1202100）

劉旸（1991－），女，新疆伊犁人，碩士研究生，研究方向?yàn)槿肭趾οx綜合防治技術(shù)，（E－mail）ly_xj1103＠163.com

（Cotresponding author）：郭文超（1966－），男，河北人，研究員，研究方向?yàn)楹οx生物防治和農(nóng)業(yè)外來(lái)入侵生物防控，（E－mail）gwc1966＠163.com周俊（1964－），女，副研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，（E－mail）1017917896＠qq.com

Fund project：Nationalkey research and developmentprogram ＂ Keytechnology research and developmentofbiologicalsafety ＂（2016YFC1202100），and the dynamic distribution and resource database construction of the main invasive alien species