雄激素通過雄激素受體途徑調控小鼠附睪Fkbp5Fkbp5基因的表達*

徐 迎陳 沁胡雙綱**

1. 上海大學生命科學學院（上海 200444）；2. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院生殖醫學科；上海市輔助生殖與優生重點實驗室

·論 著·

雄激素通過雄激素受體途徑調控小鼠附睪Fkbp5Fkbp5基因的表達*

徐 迎1,2陳 沁1**胡雙綱2**

1. 上海大學生命科學學院（上海 200444）；2. 上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院生殖醫學科；上海市輔助生殖與優生重點實驗室

目的 初步研究小鼠附睪Fkbp5（FK506 binding protein 5）基因對雄激素的響應性以及相關的分子機制。方法 建立小鼠去勢以及雄激素補充模型。采用RT-PCR以及RT-qPCR，檢測正常小鼠、去勢小鼠以及去勢后補充外源雄激素的小鼠附睪中Fkbp5基因的mRNA表達水平。搜索染色體免疫共沉淀-測序（chromatin immunoprecipitation-sequencing, ChIP-seq）數據建立的小鼠附睪全基因組雄激素受體（androgen receptor, AR）結合位點的數據庫，尋找與Fkbp5基因相關聯的AR結合位點。利用AR抗體進行染色體免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP），采用ChIP-PCR以及ChIP-qPCR的方法，檢測Fkbp5基因相關聯的AR結合位點在體內與AR的結合情況。結果 去勢后，Fkbp5基因的表達顯著降低（P＜0.05）；補加雄激素后，Fkbp5基因的表達又升至正常水平（P＜0.05）。從小鼠附睪AR結合位點的數據庫中鑒定到14個Fkbp5相關聯的AR結合位點。ChIP-PCR結果顯示，在正常生理狀態下，這14個結合位點均與AR結合。ChIP-qPCR結果顯示，去勢后，這14個AR結合位點的富集倍數均顯著下降（P＜0.05）；而補加雄激素后，這些AR結合位點的富集倍數又顯著上升至生理水平（P＜0.05）。結論 Fkbp5在小鼠附睪內的表達受雄激素的正調控，并且是AR的一個直接靶基因。該研究首次證實了Fkbp5的啟動子以及上游增強子區域存在雄激素響應元件，為探究雄激素/AR對Fkbp5的調控機制提供了新的視角。

雄激素; 雄激素受體; Fkbp5基因

附睪是雄激素依賴器官，其結構維持，功能發揮以及基因表達都受到雄激素的調控[1,2]。1973年，Orgebin-Crist等證實了雄激素對附睪內精子成熟的決定性作用[3]后，雄激素對附睪的調控作用得到深入的研究，從形態學水平，到生化水平，再到現在的分子水平[4]。雄激素的作用是由雄激素受體（androgen receptor, AR）介導的。AR是一種轉錄因子, 屬于核受體超家族成員,一旦被雄激素激活, 便進入靶細胞的核內，以高專一性、高親和力與雄激素應答元件（androgen response element, ARE）結合以調控基因轉錄[5,6]。因此，尋找和鑒定附睪內雄激素的靶基因以及與這些靶基因相關的AR結合位點（androgen receptor binding site, ARBS）和ARE，是闡明雄激素調控精子成熟的機制所必須的。

Fkbp5是免疫親和素蛋白家族的一個成員，在免疫調節以及蛋白折疊和轉運過程中發揮重要作用[7]。同時，有文獻報道，Fkbp5還可以作為分子伴侶（chaperone）蛋白與AR結合進一步增強AR的配體結合活性以及轉錄調控活性[8]。Fkbp5也是雄激素的一個靶基因，在前列腺癌細胞系以及小鼠前列腺中，Fkbp5均受雄激素的正調控，并且對雄激素的響應性遠比前列腺特異抗原基因（prostate specific antigen，PSA）快速而劇烈[9,10]，因此也被作為在體靶組織內研究雄激素調控機制的理想的模式基因。

目前，已經在Fkbp5的內含子區域和近端啟動子區域鑒定到眾多AR結合位點[9,10]，然而目前為止，在Fkbp5上游的遠端增強子區域是否含有新的AR結合位點仍然未知。本研究工作表明，在小鼠附睪組織內，Fkbp5擁有14個AR結合位點，其中有4個位于上游的遠端增強子區域。該研究為闡明AR對Fkbp5基因表達的快速調控機制提供了新的視角。

材料與方法

一、實驗動物

健康10周齡雄性C57BL/6J小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗前在動物房喂養,自由進食和飲水。

二、主要試劑

Trizol（Invitrogen公司），37%甲醛溶液（Sigma公司），2x PCR Master Mix 及PowerUp? SYBR?Green Master Mix （Thermo scientific公司），熱啟動Taq DNA聚合酶及ProtoScript?II First Strand cDNA Synthesis Kit（New England Biolabs公司），兔源AR多克隆抗體，正常兔IgG 以及protein A-agarose beads均購自Santa Cruz公司。Aprotinin，PMSF以及糖原均購自calbiochem公司。獸用丙酸睪酮注射液購自寧波第二激素廠。

三、方法

（一）小鼠去勢和雄激素補充實驗

參照文獻[11]，稍作改進后如下：總共分為3個實驗組，每組6只10周齡的雄性C57BL/6J小鼠。第1組，即正常組（normal，簡稱Nor組），手術當天處死取附睪組織。第2組，為補加玉米油組（castration+oil，簡稱oil組），在相同時間，用同樣的方式注射與第3組相同體積的玉米油，作為平行對照試驗。第3組，為補加雄激素組（castration+TP，簡稱TP組），在去勢后7 d以及8d分別腹腔注射2.5mg/只劑量的丙酸睪酮。最后一次注射后24h，處死小鼠取附睪組織。在殺死小鼠前，通過摘眼球取血的方式收集血清。每組各取3只小鼠的附睪用來做ChIP實驗，另外3只小鼠的附睪組織用于抽提組織RNA。本實驗中，無小鼠意外死亡。血清中雄激素的含量在復旦大學放射性研究所通過放射免疫測定法測定。

（二）RNA提取及RT-PCR/ RT-qPCR

組織總RNA 的制備采用Trizol試劑，按照說明書操作。逆轉錄反應按ProtoScript?II First Strand cDNA Synthesis Kit的操作流程進行。以逆轉錄產物為模板進行RT-PCR或采用PowerUp? SYBR?Green Master Mix進行RT-qPCR檢測目標基因mRNA的表達水平。PCR所用引物見表1。

表1 本文用到的引物序列

（三）染色體免疫共沉淀（C h r o m a t i n immunoprecipitation，ChIP）

主要參照文獻[12]的方法進行操作，簡述如下：小鼠附睪組織于PBS中剪碎，并洗滌除去精子和管腔液。組織碎片經1%的甲醛室溫交聯后轉入玻璃勻漿器于冰上勻漿40～50次，制成單細胞懸液，轉入2 mL EP管，離心去上清。以SDS裂解液裂解細胞并進行超聲處理以獲得長度約為500～1000 bp的染色質。超聲裂解液離心后保留上清。取15μL保存作為未經免疫沉淀的超聲處理后樣本對照（input），剩余的上清加入適量稀釋緩沖液均分為兩份，分別加入AR多克隆抗體或者正常兔源IgG，4 ℃孵育過夜。每個樣品加入50μL protein A-agarose beads，4 ℃孵育2 h，分別用洗脫緩沖液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ以及TE緩沖液洗滌兩次后，用洗脫緩沖液洗脫，經逆轉交聯及蛋白消化后，以乙醇沉淀的方法純化DNA，最后溶于適量TE緩沖液中。

（四） ChIP-PCR及ChIP-qPCR

ChIP實驗按上述方法進行。用Primer primier 5軟件設計引物，用來擴增結合位點中心位置兩側大約100～150bp的DNA片段。以2μL 100倍稀釋的超聲處理后樣本DNA（Input DNA），AR ChIPed DNA以及IgG ChIPed DNA 作為模板進行普通PCR（ChIP-PCR）或者采用PowerUp? SYBR?Green Master Mix進行熒光定量PCR（ChIP-qPCR）分析。PCR所用引物見表1。

（五）生物信息學分析

采用MatInspector軟件（Genomatix Software GmbH, http://www.genomatix.de/），在默認設置的情況下尋找AR結合位點內潛在的ARE元件。并通過在線的Weblogo軟件（http://weblogo.berkeley.edu/logo. cgi）構建ARE的序列標示（sequence logo）。

（六）統計學分析

所有實驗操作重復3 次，結果以均數±標準差表示，使用SPSS 11.0 軟件對數據進行配對t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、各組小鼠血清睪酮水平

與正常組比較，去勢后補加玉米油組小鼠血清睪酮水平顯著降低（P＜0.01），注射外源性睪酮后，去勢小鼠血清睪酮恢復到正常水平，見表2。

表2 各組小鼠血清睪酮水平比較（±s）

表2 各組小鼠血清睪酮水平比較（±s）

與Nor組比較，*為P＜0.01

組別睪酮水平 (ng/mL) Nor組 12.2±1.13 Oil組 0.6±0.14*TP組14.1±1.8

二、雄激素對小鼠附睪Fkbp5Fkbp5表達的調控

我們采用去勢和外源雄激素補充實驗研究了Fkbp5基因表達對雄激素的響應性。RT-PCR以及RT-qPCR結果表明，Fkbp5的表達與雄激素水平成正相關性。如圖1A1A和圖1B1B顯示，去勢后，Fkbp5基因的表達顯著降低（P＜0.05），補充玉米油組的表達量僅是正常組的0.23±0.06倍；補加雄激素后，Fkbp5基因的表達又顯著升高（P＜0.05），表達量與正常組基本持平，為正常組的（1.07±0.02）倍。用作陰性對照的Gapdh在正常組，補加玉米油組和補加雄激素組的表達均無顯著變化（圖1）。

圖1 RT-PCR（A）和RT-qPCR（B）檢測Fkbp5在正常小鼠（Nor組）、去勢后補加玉米油小鼠（Oil組）和去勢后補充外源雄激素小鼠（TP組）附睪內的表達情況非雄激素靶基因Gapdh用作陰性對照；與Nor組比較，*為P＜0.05，與Oil組比較，△為 P＜0.05

三、雄激素通過雄激素受體途徑調控小鼠附睪Fkbp5Fkbp5基因的表達

從前期已經報道的AR ChIP-seq實驗鑒定的小鼠附睪AR結合位點的數據庫[12]中找到14個Fkbp5相關聯的AR結合位點-ARBS1-ARBS14，其中8個位于內含子區域，2個位于啟動子區域，4個位于上游增強子區域（圖2A2A）。我們采用MatInspector軟件預測了這些結合位點內是否含有雄激素響應元件（androgen responsive element，ARE），結果表明，除了ARBS11外，其余13個結合位點內均含有至少一個潛在的ARE元件（圖2B2B）。將這些潛在ARE的序列進行多重比對，利用Weblogo軟件，將這些序列的保守信息進行分析并圖形化顯示（圖2C2C），發現這些ARE元件的保守序列與MatBase數據庫中儲存的經典的ARE序列（AGAACAnnnTGTTCT）極度相似。

圖2 Fkbp5相關聯的14個AR結合位點的位置，結合特性及ARE分析A:與Fkbp5關聯的14個AR結合位點的分布；B:14個結合位點的結合特性分析；C:14個AR結合位點包含的保守的ARE序列。ARBS: 雄激素受體結合位點 AR binding site；TSS: 轉錄起始位點 transcription start site；ARE: 雄激素響應元件 androgen responsive element

我們接下來用ChIP-PCR驗證了這些結合位點在體內與AR的結合情況。如圖3所示，14個位點均被AR所結合，而用作陰性對照的Gapdh的啟動子區（Gapdh promoter）的序列則沒有AR的富集。

AR與DNA元件的結合是雄激素依賴性的，我們因此檢測了AR與這些位點的結合是不是響應于雄激素的刺激。如圖4所示，與Nor組相比，全部14個ARBSs在Oil組中的AR結合完全消失或顯著降低，差異具統計學意義（P＜0.05）。在補加雄激素組（TP），14個ARBSs的AR結合比Oil組顯著升高，差異具統計學意義（P＜0.05），并基本回復正常水平，表明AR與這些位點的結合是雄激素依賴性的。

討 論

附睪作為男性生殖系統中的一個重要的附屬性器官，不僅是精子運行的管道和儲存的場所，也是精子成熟的主要器官。附睪是體內AR表達量最高的器官之一（www.nursa.org/10.1621/datasets.02001），并且附睪幾乎所有的生理過程都是高度雄激素依賴性的。因此附睪是研究AR在體內生理狀態下的調控規律的理想模型。

Fkbp5由于對雄激素的快速和完全響應而成為研究雄激素和雄激素受體調控機制的一個理想模式基因。我們的結果（圖1）表明，在小鼠附睪內，Fkbp5的表達受到雄激素的完全正調控，這一結果與之前報道的前列腺中的Fkbp5的表達相一致。通過搜尋前期ChIP-seq實驗得到的高分辨率的AR基因組結合位點數據庫，并加以實驗驗證，我們確定了14個與Fkbp5相關的AR結合位點以及眾多潛在的AREs，這表明Fkbp5是AR的一個直接靶基因。為了進一步佐證我們的結論，我們通過搜索附睪基因表達數據庫（http://mrg.genetics.washington.edu/），明確了Fkbp5和AR在附睪不同區域的表達變化，結果如圖5所示，AR基因和Fkbp5基因在附睪頭部和體部表達量高，而在附睪尾部表達量低。 Fkbp5和AR在附睪組織內的相似的表達模式，也暗示了它們之間的正相關性。

圖3 ChIP-PCR驗證AR結合位點（ARBS1-ARBS14）在體內與AR的結合情況非雄激素靶基因Gapdh的promoter 序列用作陰性對照。IP：未經免疫沉淀的超聲處理后樣本DNA；AR：AR抗體免疫沉淀DNA；IgG：正常兔血清免疫沉淀DNA

圖4 ChIP-qPCR驗證AR結合位點（ARBS1- ARBS14）在體內與AR的結合對雄激素的響應性與Nor組比較，*為P＜0.05，與Oil組比較，△為P＜0.05

圖5 Fkbp5和AR在小鼠附睪內的表達呈現正相關性A：Fkbp5和AR在小鼠附睪不同區域表達的平均信號值；B：Fkbp5和AR在小鼠附睪不同區域表達的示意圖。基因表達數據來自http://mrg. genetics.washington.edu/

之前已經有一些關于Fkbp5的AR調控的研究，Magee等在小鼠前列腺中確認了一個位于intron 5的ARE[9]，在小鼠3017.1細胞系中鑒定到一個位于intron 1的PRE（progesterone response element）[13]。在我們的研究中，這兩個位點都被ARBS覆蓋，分別對應于圖2A2A和圖4的ARBS4和 ARBS8，表明它們在小鼠附睪中是真正的AR結合位點。在小鼠前列腺中并不被AR所結合的位于intron 5的另外一個ARBS（圖2A2A和圖4的ARBS5），在小鼠附睪中卻是一個真正的AR結合位點，并且對AR的親和性還很高。這或許反映了AR對Fkbp5調控的組織差異性。在我們的工作之前，還沒有關于Fkbp5的5’上游遠端增強子區域AR結合位點的報道。我們的結果顯示了在小鼠附睪中AR對Fkbp5基因復雜的調控機制。

本研究中鑒定的與Fkbp5相關聯的AR結合位點，大部分位于遠離promoter區的內含子區域以及上游的遠端區域，僅有少數位于近端啟動子區。這種AR的調控模式在之前的研究中均已廣泛報道[14,15]，這或許是AR在體內發揮調控作用的主要方式。這些遠端的AR結合位點或許通過成環（looping）的方式作用于目標基因的啟動子區從而調控基因表達，就如前列腺癌細胞中AR對PSA的調控那樣[16]。AR對Fkbp5的復雜調控機制為我們闡明AR在小鼠附睪內的調控網絡提供了新的角度。

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（2016-07-08收稿）

Androgens regulate the expression of Fkbp5 through androgen receptor in mouse epididymis*

Xu Ying1,2, Chen Qin1**, Hu Shuanggang2**
1. School of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China; 2. Reproductive Medical Center, RenJi Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University; Shanghai Key Laboratory for Assisted Reproduction and Reproductive Genetics

Objectivee To investigate the responsiveness of Fkbp5 (FK506 binding protein 5) on androgen manipulation in mouse epididymis and explore its related mechanisms. Metthhooddss The castration and androgen supplementation mouse model was established. The epididymide tissues from normal, castrated and castrated but supplemented with androgen mice were collected, and their total RNA were extracted. The expressions of Fkbp5 in epididymis tissues were detected by RT-PCR and RT-qPCR. AR binding sites associated with Fkbp5 were identifi ed by searching the database of genomewide AR binding sites established by ChIP-seq in mouse epididymis. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) using ARantibody was performed, and the in vivo AR occupancies on 14 sites associated with Fkbp5 were determined by ChIPPCR and ChIP-qPCR. Results ults After castration, the expressions of Fkbp5 were signifi cantly decreased (P ＜ 0.05); after use of androgen supplement, the expressions of Fkbp5 were elevated to normal level (P ＜ 0.05). Fourteen AR binding sites associated with Fkbp5 were found in the ChIP-seq database. The ChIP-PCR data showed that the fourteen AR binding sites were occupied by AR in physiological conditions. The ChIP-qPCR data revealed that the enrichment folds of 14 AR binding sites were remarkably decreased after castration, but were signifi cantly increased to normal conditions after use of androgen supplementation. Conclusionusion Fkbp5 was a bona fi de direct target gene of AR in mouse epididymis, and its expression was positively regulated by androgen. This study shed new light on understanding of androgen/AR regulatory network in mouse epididymis.

ords androgen; androgen receptor; Fkbp5 gene

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.08.002

Q 492.4

資助：本課題受國家自然科學基金（81571435，81200468）資助

**共同通訊作者，胡雙綱，E-mail：shuangganghu@163.com；陳沁，E-mail: chenqincc@staff.shu.edu.cn