pSUPER-IL-11-shRNA表達載體的構建與鑒定*

王 偉， 陳 雪， 鐘兆銘， 儲紅映， 胡澤東， 程 瑞， 孫傳政

(昆明醫科大學第三附屬醫院 頭頸外科， 云南 昆明 650118)

?

pSUPER-IL-11-shRNA表達載體的構建與鑒定*

王 偉， 陳 雪， 鐘兆銘， 儲紅映， 胡澤東， 程 瑞， 孫傳政**

(昆明醫科大學第三附屬醫院 頭頸外科， 云南 昆明 650118)

目的： 構建及測序鑒定重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA，檢測其對甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)細胞株sw579 IL-11基因的沉默效應。方法:根據Genebank中IL-11 cDNA序列，設計并合成3對兩端有酶切位點的特異編碼IL-11shRNA序列的寡核苷酸鏈，退火成互補雙鏈后與pSUPER.retro.puro質粒載體連接，轉至大腸桿菌DH-5α菌株，挑取單個抗性克隆，提取質粒進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及測序分析，脂質體介導重組質粒轉染ATC細胞株sw579，real-time PCR及ELISA檢測其對靶基因IL-11的表達影響。結果:重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA酶切產物凝膠電泳結果顯示，3個樣本均為陽性重組質粒，測序鑒定3種重組質粒pSUPER -IL-11-shRNA序列正確，轉染3種重組質粒后sw579細胞裂解液中IL-11 mRNA和細胞培養上清液中IL-11蛋白顯著降低。結論:本研究成功構建重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA，為進一步探索IL-11在ATC進展中的作用奠定了基礎。

甲狀腺腫瘤； 白細胞介素-11； RNA，小分子干擾； 短發夾RNA； 質粒

甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)是人類惡性程度最高的腫瘤之一，占全部甲狀腺癌的1%～5%，但致死率卻占全部甲狀腺癌的14%～50%，臨床研究表明雖然甲狀腺癌治療方案不斷改進和完善，但其確診后中位生存期只有3～9個月，1年生存率約20%[1-3]，因此有必要探索新的治療手段。IL-11屬于IL-6家族，參與調控炎癥反應和腫瘤形成[4]。最近研究發現IL-11高表達與肝細胞癌、胃腺癌預后呈負相關，并促進乳腺癌、子宮內膜癌、軟骨肉瘤等實體腫瘤遠處轉移[5-7]。本課題組既往研究發現，ATC患者IL-11水平與預后呈負相關，與ATC遠處轉移正相關，推測IL-11在ATC進展中發揮了重要作用，因此有必要探索IL-11作為 ATC分子治療靶點的價值[1]。RNA干擾是利用高度保守的雙鏈小分子干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)誘發的基因沉默，阻斷體內特異基因表達，可用于探索基因功能和惡性腫瘤的基因治療[8-9]。本實驗擬設計靶向IL-11的短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)，構建IL-11的shRNA真核表達載體，轉染ATC細胞系sw579細胞，real-timePCR和ELISA技術檢測其沉默效應，為進一步探索IL-11在ATC進展中的作用及其作為治療ATC分子靶點的價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.2 方法

1.2.1IL-11 shRNA序列設計與合成 根據Genbank中目的基因IL-11序列，按shRNA的設計原則設計3個針對IL-11基因的shRNA序列[10]， Sh-IL11-1#-S序列為5′-GATCTCCGCATCTGTGCCTTATTTATTTCAAGAGAATAAATAAGGCACAGATGCTTTTTGGAAA-3′，Sh-IL11-1#-AS序列為5′-AGCTTTTCCAAAAAGCATCTGTGCCTTATTTATTCTCTTGAAATAAATAAGGCACAGATGCGGA-3′；Sh-IL11-2#-S序列為5′-GATCTCCGCCTGGGCAGGAACATATATTCAAGAGATATATGTTCCTGCCCAGGCTTTTTGGAAA-3′，Sh-IL11-2#-AS序列為5′-AGCTTTTCCAAAAAGCCTGGGCAGGAACATATATCTCTTGAATATATGTTCCTGCCCAGGCGGA-3′；Sh-IL11-3#-S序列為5′-GATCTCCGCTGGATGCTTGGGTAACTTTCAAGAGAAGTTACCCAAGCATCCAGCTTTTTGGAAA-3′，Sh-IL11-3#-AS序列為5′-AGCTTTTCCAAAAAGCTGGATGCTTGGGTAACTTCTCTTGAAAGTTACCCAAGCATCCAGCGGA-3′。行BLAST對比分析。構建3′端酶切位點之前加入Pol Ⅲ聚合酶終止信號TTTTT，以Loop(TCTCTTGAA)相連。兩端分別加入酶切位點BamHI和Hind Ⅲ，交上海Invitrogen公司合成，同時做無關序列對照。

1.2.2 表達載體的構建 將已合成的3個shRNA寡核苷酸單鏈模板稀釋至大約3 g/L。配制總體積50 μL的NEB buffer 3退火體系，正向引物1 μL，反向引物1 μL，10×緩沖液5 μL，雙蒸水43 μL，混勻，離心后置于沸水中，緩慢退火至室溫。取退火產物1 μL與pSUPER.puro.retro以TaKaRa DNA Ligation Kit中的Solution I連接后，16 ℃反應2 h，使退火產物與表達載體連接。取3種pSUPER-IL-11-shRNA連接產物42 ℃熱轉化至大腸桿菌DH-5α菌株，涂板，37 ℃恒溫箱培養過夜，氨芐青霉素(100 mg/L)篩選后，各隨機挑選1個經轉化后的孤立菌落(編號#1、#2、#3)培養用天根質粒小提試劑盒少量提取純化質粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，并送上海Invitrogen公司測序。

1.2.3 細胞培養及轉染 ATC細胞株sw579置于含10%小牛血清的DMEM培養基中，于37℃ 5% CO2的培養箱中培養。待細胞長至80%時按Lipofectamine 2000說明書，將重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA #1、#2、#3和空載質粒轉染sw579細胞，48 h后更換有1.0 mg/L嘌呤霉素(puromycin)的培養基篩選7 d左右，挑取存活細胞形成的克隆并擴大培養成穩定表達的細胞株，分別編號為IL-11KD#1、IL-11KD#2、IL-11KD#3和NC。

1.2.4 檢測IL-11 mRNA及蛋白表達水平 收集上述4種細胞，用Trizol裂解液裂解細胞并提取總RNA，按TakaRa公司試劑盒說明書逆轉錄得到cDNA, 以cDNA為模板進行real-timePCR分析，以GAPDH作對照。 收集細胞培養上清液，按IL-11 ELISA檢測試劑盒(R&D)說明書檢測上清液中IL-11蛋白濃度，并檢測細胞總蛋白濃度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行數據處理，各組質粒對sw579細胞IL-11蛋白及mRNA表達的抑制效果用率表示,組間比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA的酶切鑒定

在作文教學中，“情”“理”“法”是寫好作文的三大關鍵點，教師在作文教學中引領學生把握好這三個關鍵點，就能逐步征服作文教學這片“海洋”。

根據pSUPER.puro.retro載體的圖譜，用EcoR I和Hind III對重組質粒進行雙酶切，得到281 bp的小片段以及6 061 bp的大片段。陽性重組質粒酶切產物電泳顯示在281 bp及6 061 bp處有條帶。樣本#1、#2、#3均為陽性重組質粒。見圖1。

注：1、2、3分別為樣本，#1、#2、#3，4為陽性對照

2.2 重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA測序

重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA測序結果顯示各樣品中插入序列與設計的3個IL-11 shRNA序列完全一致，未發現堿基錯配及突變。說明構建表達IL-11shRNA的pSUPER-IL-11-shRNA真核表達載體可用于下一步沉默實驗。見圖2。

圖2 重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA測序結果

2.3 轉染重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA 的sw579細胞培養上清液中IL-11蛋白表達

IL-11KD#1、#2、#3 sw579細胞中IL-11蛋白表達量較NC組明顯降低。IL-11KD#1、#2、#3細胞相對于NC組的抑制率分別為61%、70%和52%。見圖3。

與NC組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01

2.4 轉染重組質粒pSUPER-IL-11-shRNA 的sw579細胞裂解液中IL-11 mRNA表達

Real-time PCR方法檢測轉染各干擾載體后sw579細胞裂解液中IL-11 mRNA表達情況，結果顯示IL-11KD#1、#2、#3中IL-11 mRNA表達水平較NC組明顯下調，IL-11KD#1、#2、#3組相對于NC組的mRNA抑制率分別為86%、94%和70%，見圖4。

與NC組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01

3 討論

甲狀腺未分化癌診斷時大約有20%～50%的患者已發生遠處轉移，預后極差，目前尚無公認治療模式，因此積極探索ATC的發病和進展機制，尋找治療ATC分子靶點對于改善患者預后至關重要[1-3,11-13]。既往研究發現ATC患者血小板計數以及促進血小板生成的IL-11水平均與患者預后呈負相關，且IL-11與ATC患者遠處轉移正相關，推測IL-11在ATC進展中發揮了重要作用，因此探討IL-11作為ATC分子治療靶點具有重要意義[1]。

RNA干擾及基因沉默現象首先由Fire等[14]提出，其機制是雙鏈RNA被核酸酶切割成siRNA，后者與靶基因mRNA特異結合并降解，進而抑制該基因的表達及功能[15]。制備siRNA的方法常用的有體外化學合成和DNA載體細胞內表達siRNA。前者是將化學合成的siRNA瞬時轉染進細胞，此法方便，無需構建載體等繁瑣操作，但其表達隨細胞傳代而逐漸減弱，持續時間短，不適合長時間進行細胞功能實驗。DNA載體細胞內表達siRNA為短發卡RNA表達載體法，通過DNA載體與靶序列重組后，穩定轉染進細胞核；shRNA由一條RNA 單鏈自身折疊形成雙鏈的莖，加上一條單鏈Loop環構成，在細胞內會被自動加工成21～23 bp的雙鏈siRNA，它在細胞中可與靶基因的mRNA結合并降解靶基因mRNA，從而干擾其翻譯形成蛋白質[16]，此法通過抗性基因的篩選從而獲得持續干擾目的基因的細胞株，為長期的細胞實驗提供基礎。

本文以IL-11為靶基因，根據siRNA設計原則[10]，通過RNA二級結構分析，在其mRNA的不同靶位點設計了3條針對目的基因的shRNA序列，并成功克隆至pSUPER.retro.puro質粒中，經凝膠電泳和基因測序鑒定證實成功構建了3個shRNA的表達質粒。將構建成功的3個干擾質粒分別轉染sw579細胞后，ELISA結果顯示轉染IL-11KD#1、#2、#3組的sw579細胞IL-11蛋白表達水平與mRNA表達水平均顯著降低，其抑制IL-11表達的效率都超過了50%，有效地沉默了IL-11基因的表達，該細胞模型的成功構建，為進一步研究IL-11基因對甲狀腺未分化癌生物學特性的影響及開展體內研究奠定了基礎。

[1] Sun C, Li Q, Hu Z, et al. Treatment and prognosis of anaplastic thyroid carcinoma: experience from a single institution in china[J].PLoS One, 2013(8): e80011.

[2] HaymartMR, Banerjee M, Yin H, et al. Marginal treatment benefit in anaplastic thyroid carcinoma[J]. Cancer, 2013 (17):3133-3139.

[3] Segerhammar I, Larsson C, Nilsson IL, et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid gland: treatment and outcome over 13years at one institution[J]. J Surg Oncol, 2012(8):981-986.

[4] Onnis B, Fer N, Rapisarda A, et al. Autocrine production of IL-11 mediates tumorigenicity in hypoxic cancer cells[J]. J Clin Invest, 2013 (4): 1615-1629.

[5] Casimiro S, Luis I, Fernandes A, et al. Analysis of a bone metastasis gene expression signature in patients with bone metastasis from solid tumors[J].Clin Exp Metastasis, 2012(2):155-164.

[6] Lay V, Yap J, Sonderegger S, et al. Interleukin 11 regulates endometrial cancer cell adhesion and migration via STAT3[J].Int J Oncol, 2012 (2):759-764.

[7] Li TM, Wu CM, Huang HC, et al. Interleukin-11 increases cell motility and up-regulates intercellular adhesion molecule-1 expression in human chondrosarcoma cells[J]. J Cell Biochem, 2012 (11):3353-3362.

[8] Sibley CR, Seow Y, Wood MJ. Novel RNA-based strategies for therapeutic gene silencing[J]. MolTher, 2010 (3): 466-476.

[9] Gu Y, Hou W, Xu C, et al. The enhancement of RNAi against HIV in vitro and in vivo using H-2K(k) protein as a sorting method[J]. J Virol Methods, 2012(1-2):9-17.

[10] Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interference[J]. Nat Biotechnol, 2004(3):326-330.

[11] Ito K, Hanamura T, Murayama K, et al. Multimodality therapeutic outcomes in anaplastic thyroid carcinoma: improved survival in subgroups of patients with localized primary tumors[J]. Head Neck, 2012(2):230-237.

[12] Polistena A, Monacelli M, Lucchini R, et al.The role of surgery in the treatment of thyroid anaplastic carcinoma in the elderly[J].Int J Surg, 2014(Suppl 2):170-176.

[13] Onoda N, Kashiwagi S, Noda S, et al.High efficacy of chemoradiation therapy sensitized by weekly docetaxel for anaplastic thyroidcancer[J].Anticancer Res, 2013(8):3445-3448.

[14] Russo J, Harrington AW, Steiniger M.Antisense Transcription of Retrotransposons in Drosophila: An Origin of Endogenous Small Interfering RNA Precursors[J].Genetics, 2016(1):107-121.

[15] Olejniczak M, Urbanek MO, Jaworska E, et al.Sequence-non-specific effects generated by various types of RNA interference triggers[J].Biochim Biophys Acta, 2016 (2):306-314.

[16] Burroughs AM, Ando Y, Aravind L.New perspectives on the diversification of the RNA interference system:insights from comparative genomics and small RNA sequencing[J].Wiley Interdiscip Rev RNA, 2014 (2):141-181.

(2016-08-02收稿，2016-11-01修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 劉 華

《貴陽醫學院學報》更名啟事

經國家新聞出版廣電總局(新廣出審〔2016〕267號文)批準，原《貴陽醫學院學報》更名為《貴州醫科大學學報》，國內統一連續出版物號由CN52-5012/R更改為CN52-1164/R，主管、主辦單位變更為貴州醫科大學，出版單位變更為《貴州醫科大學學報》編輯部(為貴州醫科大學內設機構)。其他登記項目不變。

特此公告

《貴州醫科大學學報》編輯部

Construction and Identification of pSUPER-IL-11-shRNA

WANG Wei, CHEN Xue, ZHONG Zhaoming, CHU Hongying, HU Zedong, CHEN Rui, SUN Chuanzheng

(DepartmentofHeadandNeckSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650118,Yunnan,China)

Objective: To construct and identify pSUPER-IL-11-shRNA and detect the silencing effect of IL-11 gene of sw579 cell line of anaplastic thyroid carcinoma (ATC). Methods: According to IL-11 cDNA gene sequence in the Gene bank, three pairs of oligonucleotides with specific coding IL-11shRNA sequence, each containing the sites of restriction endonuclease at both ends, were designed and synthesized. After annealing, the complementary double strands were connected with pSUPER.retro.puro plasmid vector, which was transfected into DH-5α bacterial strain. The single resistance clone was collected. The plasmid was extracted and the recombinants were identified by 1% agarose gel electrophoresis, sequenced and analyzed. Liposome mediated recombinant plasmid was transfected into sw579 cell line of ATC, and real-time PCR and ELISA were adopted to detect its effect on the expression of target gene IL-11. Results: The results gel electrophoresis for enzyme-digested product showed that the pSUPER IL-11shRNA was successfully constructed. 3 samples were all positive recombinant plasmids, and the sequences of 3 recombinant plasmids of pSUPER-IL-11-shRNA were identified by sequencing. IL-11 mRNA in sw579 cell lysis solution and IL-11protein in cell culture supernatant of sw579 cells were significantly decreased after transfection of 3 recombinant plasmids. Conclusion: pSUPER-IL-11shRNA expression vector has been successfully constructed, and makes it possible to further explore the role of IL-11 in ATC.

thyroid neoplasm; interleukin-11; RNA， small molecule interference; short hairpin RNA; plasmid

國家自然科學基金(81560470,81260402); 云南省高層次衛生技術人員專項經費(D-201243); 云南省中青年學術技術帶頭人后備人才專項經費(2015HB086)

E-mail:scz008@126.com

時間：2016-11-15 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.014.html

R34-33； R736.1

A

1000-2707(2016)11-1269-05

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.007