利用DNA條形碼技術發現貴州省蚋類新記錄*

張圣芳， 賈 若， 楊曜銘， 王 毅， 尋 慧， 陳漢彬， 楊 明**

(1.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550004)

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利用DNA條形碼技術發現貴州省蚋類新記錄*

張圣芳1， 賈 若2， 楊曜銘2， 王 毅2， 尋 慧2， 陳漢彬2， 楊 明2**

(1.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550004)

目的： 綜合利用DNA條形碼序列和形態學特征鑒定蚋種。方法：利用車載式捕蟲網于2014年7～9月在貴州省雷山、江口、德江、關嶺和開陽5縣采集蚋類標本,并進行初步的形態學鑒定；測定雌蚋DNA條形碼序列，利用生命數據條形碼系統(BOLD)及系統發育分析方法鑒定蚋種。結果：初步確定劃分蚋屬下蚋種的K2P距離閾值為4%，利用該閾值及生命數據條形碼系統鑒定153只雌蚋為麻子繩蚋。結論：麻子繩蚋為貴州省蚋類新記錄，分布于雷山、江口、德江、關嶺和開陽5縣。

蚋科； DNA條形碼； 生物形態； 貴州； 生命數據條形碼系統； 系統發育分析

蚋類，又稱黑蠅(Black fly)，屬于雙翅目(Diptera)、蚋科(Simuliidae)，是醫學昆蟲中一類重要的媒介昆蟲。蚋類通過刺叮吸血，騷擾人畜禽或傳播疾病，在生活和生產上給人類帶來不同程度的危害[1]。蚋類具有突出的形態相似性，種屬鑒定通常需要不同發育時期(包括幼蟲、蛹和成蟲)的成套標本，對單一蟲期標本的鑒定往往十分困難[2]。近年來，本研究借鑒國外方法，利用車載式捕蟲網采集蚋類成蟲，涉及對單個雌蟲進行鑒定的問題[3]。單個雌蟲無法用形態學方法予以準確鑒定，需利用DNA條形碼技術(DNA barcoding)進行輔助鑒定。DNA條形碼技術由Hebert等[4]于2003年提出，核心思想是以線粒體COⅠ基因5′端一長658 bp的序列(稱為DNA條形碼)作為鑒定動物物種的通用遺傳標記，該技術在雙翅目、直翅目、膜翅目、蜻蜓目[9]等昆蟲的物種鑒定上得到了很好的應用，該技術也應用于蚋類種屬鑒定[5-10]。Conflitti等[11]結合DNA條形碼與地理及生態信息鑒定克蚋屬(Cnephia)5蚋種，Day和Bernotien等[12-13]以DNA條形碼來厘清爬蚋復組(S.reptanscomplex)的近緣種分類問題。本研究室2008年開始蚋類COⅠ基因序列研究，逐漸建立了可用于貴州省蚋類鑒定DNA條形碼大綱(profile)[14]。貴州省蚋類分類學研究比較成熟，現已發現1屬35種[2]。本文用DNA條形碼技術對車載式捕蟲網采集到的蚋類進行研究，結合系統發育分析方法，發現尚未報道分布于貴州省的蚋種麻子繩蚋(S.asakoae)，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與軟件

體視顯微鏡(日本)、電熱恒溫水浴鍋(中國)、UVP凝膠成像系統(美國)、梯度PCR擴增儀(德國)、蛋白核酸分析儀(美國)、Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物技術有限公司)、2X Taq PCR Master Mix(含染料)(上海生工生物技術有限公司)、Trans 2k DNA Marker(上海生工生物技術有限公司)、Trans DNA Marker I(上海生工生物技術有限公司)。主要應用軟件為Chromas 2.41、DNAMAN V6、MEGA 6.06和PHYLIP 3.695。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 參照Davies和Roberts[3]的方法，設計制作車載式捕蟲設備，采集蚋類成蟲。于2014年7～9月在貴州雷山、江口、德江、關嶺和開陽進行采集。依據蚋喜于晨曦和薄暮尋求血源、侵襲人畜最為頻繁的特點，選擇采集時間在日出和日落前后1 h。

1.2.2 形態學鑒定 在體視鏡下解剖雌蚋，尾器制片作為憑證標本，蚋其余部位保存于95%酒精中，用于提取基因組DNA。按常規方法進行形態學鑒定[1]。

1.2.3 基因組DNA提取 使用上海生工生物公司Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取單個蚋基因組DNA，-20 ℃貯存備用。

1.2.4 PCR引物選擇 沿用本課題組自行設計的蚋類COⅠ基因通用引物cu1cd2和Hebert等[4]的引物序列Lco14490Hco2198。cu1的引物序列為5′-ACC ACT TTT ATC AGC CAT TT-3′，cd2的引物序列 5′-CAC TAA TCT GCC ATA TTA GA-3′，產物約1 600 bp。Lco14490的引物序列為 5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′，Hco2198引物序列為5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′，產物約710 bp。引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2.5 PCR擴增反應體系 PCR擴增應體系的總體積為25 μL，包括12.5 μL PCR MasterMix，10.7 μL蒸餾水，0.4 μL的上游引物和0.4 μL的下游引物，1 μL模板。反應條件為：94 ℃預變性5 min后進入30個循環，94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.6 PCR產物檢測與測序 吸取5 μL PCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓180 V電泳20 min，在UVP凝膠成像系統下觀察并記錄結果。PCR產物測序由英濰捷基公司進行，雙向測序。

1.2.7 蚋類COⅠ基因序列處理 用DNAMAN V6序列拼接程序剪切出用于分析的658 bp DNA條形碼序列。

1.2.8 蚋種鑒定 在BOLDSYSTEMS的動物COⅠ鑒定頁面(http://boldsystems.org/ index.php/ IDS_OpenIdEngine)中輸入待鑒定的蚋類COⅠ基因658 bp序列，提交鑒定，并記錄結果[15]。

1.2.9 K2P距離(Kimura-2-parameter distance)分析 利用PHYLIP3.695軟件中的dnadist程序進行。

1.2.10 序列比對與系統發育分析 用 MEGA6.06軟件包的Alignment Explorer工具進行序列比對[16-17]。以鄰接法(neighbor-joining，NJ)進行系統發育分析，選擇K2P模型，Bootstrap值設為1 000。

2 結果

根據形態學特征，對153個屬同一蚋種(但不是貴州省已知蚋種)的雌蚋個體(表1)進行COⅠ基因序列分析。測定153個個體的DNA條形碼序列，共得28種不同序列，其他125個個體的序列分別與這28種序列相同。28種序列的K2P距離最大為3.7%。用BOLDSYSTEMS對28種序列進行鑒定，17種被鑒定為麻子繩蚋Simulium(Gomphostilbia)asakoae，11種未得到鑒定。檢索GenBank和BOLDSYSTEMS中包含完整658bp條形碼且已知蚋種的蚋屬(Simulium)序列，分別獲得464條和

表1 153個雌蚋的分布

Tab.1 Distribution of 153 female blackflies

采集地采集地經緯度數目雷山26°23'36.24″N,108°4'28.92″E17江口27°41'22.13″N,108°50'44.79″E76德江28°15'19.29″N,108°06'52.25″E7關嶺25°55'59.46″N,105°36'25.42″E23開陽27°03'14.13″N,106°58'30.83″E30

486條序列，與本課題組之前測定的103條已知蚋種序列(未發表)一起，成為包含1 053條序列的蚋類DNA條形碼大綱。該大綱含149個蚋種，平均K2P距離為14.7%。在149個蚋種組成的11 026個物種對中，僅有104對的K2P距離小于4%，占全部物種對的0.9%。因此，選擇4%的K2P距離為劃分蚋屬下蚋種的閾值。以上述28種序列與蚋類DNA條形碼大綱的1 053條序列一起，進行系統發育分析，發現28種序列與已知麻子繩蚋序列(共3條，GenBank編號為KM410170、KM410171和KM410172)構成單獨的分支(branch)。28種序列與已知麻子繩蚋序列(3條)的K2P距離為1.1%～3.4%，在種內差異范圍內。28種序列與已知非麻子繩蚋序列(1 050條)的K2P距離為5.7%～21.1%，達到種間差異水平。進一步檢視28種序列相應的尾器憑證標本(圖1)，發現符合麻子繩蚋形態特征，即生殖板三角形、內緣骨化和側緣中凹，生殖叉突前臂骨化、后臂無外突及兩端骨化，從而確認28種序列代表的蚋種為麻子繩蚋。麻子繩蚋為貴州省蚋類新記錄，分布于雷山、江口、德江、關嶺和開陽5縣。

圖1 麻子繩蚋雌性尾器(40×)

3 討論

現已知蚋類2 204種，其中，蚋屬1 745種[18]。我們根據蚋屬149種的已知DNA條形碼，初步確定以4%的K2P距離為劃分蚋屬下蚋種的閾值。由于149個蚋種構成的物種對中，K2P距離小于4%的占0.9%，意味著以4%為蚋種劃分標準，準確性可以達到99%以上。Hebert等[4]在研究鱗翅目昆蟲時，以3%(K2P)為判斷物種的閾值，準確性可達到98%。Hebert等[4]認為，同一屬下的物種，可能因為成種時間晚近，而使得COⅠ基因序列的趨異較小。對于K2P距離較小(<4%)的蚋類物種對，可能還存在其他解釋。例如，在我們分析的149個蚋種中，節蚋(S.nodosum)和素木蚋(S.shirakii)的DNA條形碼序列完全一致，即K2P距離為0，說明節蚋和素木蚋很可能就是同一蚋種。關于節蚋和素木蚋是否為同一蚋種，在分類學上尚存在爭議，這與本課題組的研究結果相符。

已報道麻子繩蚋分布于馬來西亞、泰國、越南及中國香港[2,18]，因此本文綜合形態特征、BOLDSYSTEMS鑒定和系統發育分析所鑒定的麻子繩蚋，為貴州省新記錄種。貴州省已知的蚋屬35蚋種，均為在幼期孽生地(河流、溪流)采集標本，對幼期標本(幼蟲或蛹)及從蛹羽化而得的成蟲進行鑒定而定種[2]。本文報道的貴州省新記錄麻子繩蚋，系以車載式捕蟲網采獲，且發現該蚋種在貴州省分布較為廣泛，分布于雷山、江口、德江、關嶺和開陽5縣。但以傳統方法采集標本時，并未發現該蚋種，說明車載式方法對于蚋類研究是一個很好的補充。

[1] 陳漢彬, 安繼堯. 中國黑蠅(雙翅目：蚋科)[M]. 北京: 科學出版社, 2003：1-448.

[2] 陳漢彬. 中國蚋科昆蟲[M]. 貴陽: 貴州科技出版社, 2016：1-673.

[3] Davies L, Roberts DM . A net and a catch-segregating apparatus mounted in a motor vehicle for field studies on flight activity of Simuliidae and other insects[J]. Bull Entomol Res, 1973(1): 103-112.

[4] Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proc Biol Sci, 2003(3): 313-321.

[5] 閆嬌, 姜麗, 郭琴,等. DNA條碼技術在雙翅目昆蟲中的應用[J]. 天津師范大學學報, 2015(3): 66-72.

[6] 梁亮, 江威, 余慧,等. 中國果實蠅屬種類的DNA條形碼鑒定(雙翅目:實蠅科)[J]. 動物分類學報, 2011(4): 925-932.

[7] 潘程瑩, 胡婧, 張震等. 斑腿蝗科Calantopidae七種蝗蟲線粒體COⅠ基因的DNA條形碼研究[J]. 昆蟲分類學報, 2006(2): 103-110.

[8] Li YW, Zhou X, Feng G, et al.COIand ITS2 sequences delimit species, reveal cryptic taxa and host specificity of fig-associatedSycophila(Hymenoptera, Eurytomidae)[J]. Mol Ecol Resour, 2010(1): 31.

[9] Rach J, DeSalle R, Sarkar IN, et al. Character-based DNA barcoding allows discrimination of genera, species and populations in Odonata[J]. Proc Biol Sci, 2008(2): 237-247.

[11]Conflitti IM, Pruess KP, Cywinska A, et al. DNA barcoding distinguishes pest species of the black fly genusCnephia(Diptera: Simuliidae)[J]. J Med Entomol, 2013(6): 1250-1260.

[12]Day JC, Goodall TI, Post RJ. Confirmation of the species status of the blackflySimuliumgaleratumin Britain using molecular taxonomy[J]. Med Vet Entomol, 2008(1): 55-61.

[13]Bernotien R, Stun NAS V. On the biology ofSimuliumgaleratumin Lithuania ecological and molecular data[J]. Ekologija, 2009(2): 123-126.

[14]羅洪斌, 楊明, 陳漢彬. 克隆醫學昆蟲蚋COⅠ全基因的引物設計方法探討[J]. 湖北民族學院學報:醫學版, 2008(3): 12-14.

[15]Ratnasingham S, Hebert PDN. BOLD: The barcode of life data system (www.barcodinglife.org) [J]. Mol Ecol Notes, 2007(3): 355-364.

[16]Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J]. J Mol Evol, 1980(2):111-120.

[17]Tamura K., Stecher G., Peterson D,etal. MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Mol Biol Evol, 2013(12): 2725-2729.

[18]Adler PH, Crosskey RW. World blackflies (Diptera: Simuliidae): A comprehensive revision of the taxonomic and geographical inventory[M]. Clemson: Clemson University, 2016：1-126.

(2016-08-01收稿，2016-11-03修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 劉 華

A New Record of Simuliidae Found by DNA Barcoding in Guizhou Province

ZHANG Shengfang1, JIA Ruo2, YANG Yaoming2, Wang Yi2, XUN Hui2, CHEN Hanbin2, YANG Ming2

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China;2.BasicMedicalCollege,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guihzou,China)

Objective: To identify blackfly species with combined data of DNA barcodes and morphological characteristics. Methods: Blackflies were collected with a vehicle-mounted trap on July to September of 2014 at Leishan, Jiangkou, Dejiang, Guanling, and Kaiyang counties in Guizhou Province, and preliminary morphological identification was performed. Female simulium DNA barcode sequence was detected. Barcode of Life Data Systems (BOLD) and phylogenetic analysis methods were adopted to identify blackfly species. Results: It was preliminarily determined that the threshold value of K2P distance in differentiating Simulium blackfly species and 153Simulium(Gomphostilbia)asakoaeindividuals were identified with BOLD and the threshold value. Conclusion: S. (G.) asakoae is a new record of blackfly, distributing at Leishan, Jiangkou, Dejiang, Guanling, and Kaiyang in Guizhou Province.

simuliidae; DNA barcode; organism forms; Guizhou; barcode of life data systems; phylogenetic analysis

貴州省社會發展攻關項目[黔科合SY(2012)3083]； 國家自然科學基金(30660021)

?? E-mail:id.yang.ming@gmail.com

時間：2016-11-15 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.028.html

R384.5； Q962

A

1000-2707(2016)11-1245-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.002