興義維蚋蚋卵(胚胎)原代培養細胞核型分析*

周 靜， 劉占鈺， 徐 旭， 崔立秋， 陳漢彬， 楊 明**

(1.貴州醫科大學 生物與工程學院， 貴州 貴陽 550004； 2.贛南醫學院第一附屬醫院 檢驗科， 江西 贛州 341000； 3.貴州醫科大學附院 肝病實驗室， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550004)

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·專題研究1·

興義維蚋蚋卵(胚胎)原代培養細胞核型分析*

周 靜1， 劉占鈺2， 徐 旭3， 崔立秋4， 陳漢彬4， 楊 明4**

(1.貴州醫科大學 生物與工程學院， 貴州 貴陽 550004； 2.贛南醫學院第一附屬醫院 檢驗科， 江西 贛州 341000； 3.貴州醫科大學附院 肝病實驗室， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550004)

目的： 分析興義維蚋蚋卵(胚胎)原代培養細胞核型。方法：應用組織塊法處理野外采集興義維蚋蚋卵(胚胎)，以改良Shields and Sang M3為基礎培養基，pH 6.0～6.5，置于28 ℃生化恒溫培養箱中進行原代細胞培養，選取10個處于有絲分裂增殖時期的細胞，通過秋水仙素處理，制作中期染色體標本，進行核型分析。結果：顯微鏡下觀察，前中期染色體為3對(2n=6)，染色體凝集程度未達最大化呈現長桿狀，染色體長度為9.43～13.58 μm；中期染色體為3對(2n=6)，高度凝集呈現短桿狀，染色體長度為2.43～4.67 μm，兩條中期染色體臂比值<1.67，屬中著絲粒染色體，4條染色體臂比值>1.67，屬亞中著絲粒染色體。結論：初步闡析了興義維蚋蚋卵(胚胎)原代培養細胞核型特征。

蚋科； 興義維蚋； 胚胎； 原代細胞； 核型分析

蚋類，俗稱黑蠅(blackflies)，是一類小型駝背的雙翅目吸血昆蟲，可在人類和禽畜中傳播盤尾絲蟲病(onchocerciasis)、禽鳥住白細胞蟲病(Leucocytozoonsis)和水泡性口炎(vesicular stomatitis)等，嚴重危害人類和禽畜的健康和安全，對蚋類生態習性的研究對蚋類的生物防治具有重要的理論和臨床意義。迄今，全球已知現生的2 151蚋種中，研究人員已對390種進行了細胞學研究[1-2]。蚋類細胞通過有絲分裂確保遺傳物質傳遞，使得細胞分化和組織發生得以實現，確保了蚋蟲的生長發育。對于蚋類原代細胞染色體的核型分析，可以豐富蚋類遺傳學知識體系，指導蚋類分類系統研究，并為蚋類細胞系建立提供鑒定依據[3]。目前，國外學者對蚋類染色體在形態分類中的作用進行了研究[4-6]，國內學者主要對河南紡蚋、黑山水蚋和興義維蚋等唾腺多線染色體進行研究[7-11]，這些研究主要是通過組織標本進行蚋類染色體研究，而對于蚋類細胞有絲分裂增殖過程中染色體的核型研究尚無相關報道。本研究以貴州省貴陽市郊區興義維蚋蚋卵(胚胎)為研究材料，在適宜的細胞培養基和培養條件下對蚋卵(胚胎)組織進行原代細胞培養，選取處于增殖生長旺盛時期的原代培養細胞，制備原代細胞前中期和中期染色體，進行核型分析,以期為蚋類細胞系鑒定奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

用于原代細胞培養的組織均為蚋科前幼蟲期卵塊標本，從貴陽市郊區(花溪、羊昌、烏當)野外采集蚋卵(胚胎)，未發育至前幼蟲期蚋卵可經蚋類槽式循環飼養系統處理，待其發育至前幼蟲期(肉眼為棕黑色，鏡下通過透明卵殼可見紅眼點出現，破卵器形成)[1]，經鑒定為興義維蚋后用于原代細胞培養。

1.2 方法

1.2.1 原代細胞培養及觀察 將野外采集的蚋卵(胚胎)從卵閥上分離，無菌水清洗4～5次進行消毒前預處理；70%乙醇浸泡10 min，無菌水沖洗2～3次；1%過氧乙酸浸泡15 min，無菌水沖洗3～4次；2.8% NaClO浸泡5 min，無菌水沖洗4～5次[12]。將消毒好的蚋(卵)胚胎吸入2 mL離心管中，眼科剪剪碎，加入1/2體積的0.25%胰蛋白酶，27 ℃處理10 min，紗布過濾，濾液800 r/min，離心5 min，去除上清，應用改良型Shields and Sang M3(20% FBS、500 U/mL青霉素、500 mg/L硫酸鏈霉素、12.5 mg/L兩性霉素B、5 mg/L胰島素)細胞培養基懸浮組織細胞并計數，按1×105個/mL，接種于經多聚賴氨酸 (PLL) 處理一次性塑料培養皿中，置于28 ℃生化恒溫培養箱中培養。組織細胞懸液接種后，根據細胞生長情況，進行1/2、1/3及1/4部分換液，倒置顯微鏡下定期觀察組織細胞的貼壁情況及細胞的遷移、增殖狀態，并拍照分析。

1.2.2 原代細胞染色體制備 選取處于有絲分裂增殖期的原代培養細胞，秋水仙素培養處理5～6 h，KCl低滲處理2次，Carnoy’s固定液固定后置于載玻片上，姬姆薩染色，中性樹膠封片。在40倍物鏡下尋找背景干凈、染色體分散較好的有絲分裂相，在100倍物鏡下CCD獲取染色體圖像。選取染色體分散較好的10個分裂相細胞，進行染色體計數，測量染色體的長度，計算臂比值，對染色體進行分類[13]。統計分析各條染色體的相對長度，根據相對長度對染色體進行列隊，排出核型圖，進行核型分析[14-16]。

2 結果

2.1 原代細胞培養

根據細胞生長情況，定期對原代培養細胞進行換液處理。蚋卵(胚胎)組織塊接種12 h后，組織細胞貼壁生長；培養1周，大量細胞從組織塊周圍脫落遷移生長。培養3周，可見圓形細胞有絲分裂為兩個子代細胞(圖1A)，細胞增殖較為明顯(圖1B)。該時期細胞增殖活躍，可作為蚋卵(胚胎)原代細胞核型分析材料。

2.2 核型分析

選取染色體分散較好的前中期或中期分裂相細胞共10個進行拍照，顯示前中期染色體為3對(2n=6)，按照染色體長度進行編號排序，3對染色體分別以Ⅰ1、Ⅰ2，Ⅱ1、Ⅱ2，Ⅲ1、Ⅲ2進行編號，該期染色體長度為9.43～13.58 μm(表1)。中期染色體染色體為3對(2n=6)，染色體編號與前中期相同，該期染色體長度為2.43～4.67 μm，臂比值結果顯示2條染色體為中著絲粒染色體，4條染色體為亞中著絲粒染色體(表2)。蚋卵(胚胎)原代細胞染色體核型模式圖顯示：前中期染色體未達最大化凝集呈現長桿狀(圖2A),染色體數目2n=6，按照染色體長度進行編號排序(圖2B)；中期染色體高度凝集呈現短桿狀(圖3A)，按照臂比值可劃分為中著絲粒和亞中著絲粒染色體，并對其進行編號排序，其中中著絲粒染色體2條、占總染色體數目的1/3，亞中著絲粒染色體4條、占總染色體數目2/3(圖3B)。

表1 興義維蚋蚋卵前中期染色體長度

Tab.1 The measurement of prometaphase chromosomes ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense

染色體編號前中期染色體長度(μm)Ⅰ113.58Ⅰ213.46Ⅱ111.25Ⅱ210.47Ⅲ19.57Ⅲ29.43

表2 興義維蚋蚋卵中期染色體絕對長度、相對長度、臂比值、染色體類型(x±s)

Tab.2 The statistics of metaphase chromosome ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense

注：p為短臂，q為長臂，M為中央著絲粒，SM為亞中央著絲粒

3 討論

昆蟲核型分析是對細胞前中期和中期染色體數目、大小、形態等特征的分析研究[17]。對于遺傳疾病機制、物種親緣關系與進化，遠緣雜種的鑒定具有重要意義，同時也是建立細胞系時對不同物種來源細胞系鑒定的最佳方法[18-20]。

蚋類核型分析是蚋類遺傳防治和蚋類分類鑒定的重要實驗方法，本研究主要通過興義維蚋蚋卵(胚胎)原代細胞培養，選取細胞增殖過程中處于有絲分裂旺盛時期的原代細胞制作染色體，進行核型分析。研究結果顯示興義維蚋前中期和中期染色體數目均為3對(2n=6)，中期染色體高度凝集長度在4 μm左右，Ⅰ號染色體具中央著絲粒，Ⅱ和Ⅲ號染色體均為亞中央著絲粒(圖3)。與黃麗等[10]制備興義維蚋唾腺多線染色體數目2n=6相一致。興義維蚋多線染色體是唾腺細胞中多股染色單體平行排列形成一種纜狀巨大染色體，長度在20 μm左右[8]。

本研究主要是展示了蚋類原代細胞有絲分裂過程中前中期和中期染色體核型特征，一方面可協助分子分類鑒定培養細胞的種屬來源；另一方面，完善了蚋類原代細胞培養的歷史檔案，便于與后期建成的細胞系的核型特征進行比較分析。不同蚋種來源細胞中期染色體在數量上較恒定(2n=6)。但對于不同蚋種細胞中期染色體大小、形態及帶型上的差異及規律還有待進一步探索研究。

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注:A為兩個有絲分裂子代細胞，B為多個有絲分裂子代細胞

前中期染色體 前中期染色體核型

中期染色體 中期染色體核型

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(2016-07-30收稿，2016-11-11修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 劉 華

Karyotype Analysis of Primary Cells Cultured from Blackfly Eggs(Embryos) ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense

ZHOU Jing1, LIU Zhanyu2, XU Xu3, CUI Liqiu4, CHEN Hanbin4, YANG Ming4

(1.CollegeofBiologyandEngineering,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalCollege,Gannan341000,Jiangxi,China; 3.LiverDiseaseLaboratory,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.CollegeofBasicMedicalSciences,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To culture primary cells of blackfly eggs (embryos) and analyze their karyotype. Methods: The tissue block method was applied to treat the blackfly eggs (embryos) fromSimulium(Wilhelmia)xingyiensethat were collected in field. The blackfly eggs (embryos) were cultured in the modified Schneider's and Sang M3 medium at pH 6.0～6.5, and incubated in a biochemical incubator at 28 ℃. The primary cells in the mitotic and proliferative phase were selected and treated with colchicine, and their metaphase chromosomes were prepared for karyotype analysis. Results: The prometaphase chromosomes are 3 pairs(2n=6), which were not aggregated at a maximum degree and showed themselves long rhabditiform, and the length of chromosome is 9.43～13.58 μm. Metaphase chromosome was 3 pairs (2n=6), and which were highly aggregated and showed themselves short rhabditiform, and the length of chromosome was 2.43～4.67 μm. Two metaphase chromosomes' arm ratio is less than 1.67, belonging tocentric chromosome, and the 4 chromosomes' arm ratio is more than 1.67, belonging to the submetacentric chromosome. Conclusions: The karyotype characteristics of primary cells cultured from the blackfly eggs (embryos) ofSimulium(Wi.)xingyiensewere preliminarily elucidated in this study.

Simuliidae；Simulium(Wilhelmia)xingyiense; embryos; primary cells; karyotype analysis

國家自然科學基金(30660021)； 貴州省社會發展科技攻關計劃[黔科郝曉宇合(2012)3100]； 貴州省科技計劃項目[黔科合LH字(2016)7357]； 貴州醫科大學高等學校2015年大學生創新創業訓練計劃項目(201510660034)

?? E-mail:culex@gmc.edu.cn

時間：2016-11-15 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.021.html

Q962； R384.5

A

1000-2707(2016)11-1241-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.001