Delta-catenin蛋白通過抑制JNK通路活性而減少肺癌細胞的凋亡

董彩鳳，孫麗紅，張　健，張朝軍，張俊毅

1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.烏海市人民醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 烏海 016000；4.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；

Delta-catenin蛋白通過抑制JNK通路活性而減少肺癌細胞的凋亡

董彩鳳1，孫麗紅2，張健3，張朝軍1，張俊毅4

1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.烏海市人民醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 烏海 016000；4.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；

背景與目的：作為黏附蛋白catenin家族中的一員，Delta-catenin蛋白可以促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，然而其提高腫瘤細胞增殖能力的機制并不清楚。本研究檢測了Delta-catenin對肺癌細胞凋亡的影響及其與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein hinase，MAPK)信號通路蛋白的關(guān)系，并初步探索了Delta-catenin促進腫瘤細胞侵襲增殖的可能機制。方法：采用蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測肺癌細胞過表達Delta-catenin前后p38、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)蛋白活性的變化，同時利用流式細胞術(shù)檢測了腫瘤細胞凋亡數(shù)量的改變，還通過Matrigel基質(zhì)膠侵襲實驗檢測了腫瘤細胞侵襲數(shù)量的變化。結(jié)果：與未處理組和空載體對照組相比，過表達Delta-catenin后肺癌細胞的p38蛋白活性沒有變化(P＞0.05)，但JNK的蛋白活性卻顯著減少(P＜0.05)，與此同時，腫瘤細胞的凋亡比例顯著下降(P＜0.05)，而腫瘤細胞的侵襲能力卻明顯增強(P＜0.05)。結(jié)論：Delta-catenin可能通過抑制肺癌細胞JNK通路的活性而減少腫瘤細胞的凋亡，進而促進腫瘤細胞的侵襲。

Delta-catenin；肺癌；細胞凋亡；c-jun氨基末端激酶通路

Delta-catenin蛋白(也被稱之為NPRAP蛋白，基因名稱為CTNND2)作為黏附蛋白catenin家族中的一員，其在腫瘤演進過程中所發(fā)揮的作用越來越受到人們的關(guān)注。數(shù)篇文獻報道了Delta-catenin在食管癌［1］、前列腺癌［2］、大腦星形細胞瘤［3］及卵巢癌［4］中的表達明顯增高且和患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。特別是我們的研究結(jié)果證實，在非小細胞肺癌中存在Deltacatenin蛋白的高表達［5］，且Delta-catenin的表達促進了肺癌細胞的增殖和侵襲。然而，上述結(jié)果僅僅是一些表面現(xiàn)象，Delta-catenin促進肺癌增殖侵襲的具體機制以及究竟哪條信號通路參與了Delta-catenin對肺癌細胞凋亡的影響目前尚不明確。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員在細胞的生物學(xué)活動中發(fā)揮重要作用，特別是p38和c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)通路參與了細胞受到外界刺激時引起的細胞凋亡［6-9］。有文獻報道，在神經(jīng)元中JNK可以通過磷酸化Delta-catenin而使后者通過蛋白酶體途徑降解，從而使Delta-catenin促進神經(jīng)元突觸形成的能力顯著降低［10］。本研究旨在探討Deltacatenin對JNK通路活性的影響，以及Deltacatenin能否通過降低JNK通路的活性而減少腫瘤細胞的凋亡并促進瘤細胞的侵襲、增殖等生物學(xué)行為。

1　　材料和方法

1.1細胞培養(yǎng)

人肺腺癌細胞系SPC-A-1(以下稱SPC)、SK-MES-1(以下稱SK)均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。上述細胞系培養(yǎng)于含100 U/mL青鏈霉素(購自美國Sigma-Aldrich公司)和10%FBS(購自美國Gibco公司)的RPMI-1640或DMEM(購自美國Gibco公司)培養(yǎng)基中。在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)。每2天用0.25%胰酶(購自美國Invitrogen公司)消化傳代。

1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

含人源性全長Delta-catenin cDNA的質(zhì)粒pCMV5-FLAG/Delta-catenin由日本神戶大學(xué)Nakamura博士惠贈［11］，并經(jīng)寶生物工程(大連)有限公司擴增和驗證。用LipofectamineTM2000(購自美國Invitrogen公司)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pCMV5-FLAG/Delta-catenin質(zhì)粒導(dǎo)入SPC或SK肺癌細胞系中，并以空載體pCMV5作為陰性對照。實驗分3組：未處理組、空載體對照組、Delta-catenin過表達組。

1.3蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測

用RIPA裂解液(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)充分裂解收集的細胞，收集上清液并進行蛋白定量。取等量總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜(購自美國Millipore公司)，再分別與一抗Delta-catenin、p38、磷酸化的p38(p-p38)、JNK、磷酸化的JNK(p-JNK)和β-actin(均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)在4 ℃條件下溫育過夜。隨后PVDF膜與HRP標記山羊抗小鼠二抗(購自美國Santa Cruz公司)在室溫下溫育2 h，再經(jīng)ECL發(fā)光(購自美國Pierce公司)并曝光膠片(購自日本富士膠片株式會社)。目的蛋白/β-actin的灰度比值作為該目的蛋白的相對表達量。

1.4細胞凋亡測定

收集對數(shù)生長期細胞并制成1×107個/mL的細胞懸液。取1 mL細胞懸液用75%冷乙醇于4 ℃固定過夜，離心(110×g，2 min)后制成500 μL的細胞懸液，加50 μg/mL的PI染液(購自美國Sigma-Aldrich公司)，于4 ℃避光染核45 min后上流式細胞儀(購自美國BD公司)檢測，采用ModFit LT 3.0軟件分析細胞凋亡比例。

1.5細胞侵襲實驗

利用Matrigel基質(zhì)膠(購自美國BD公司)和Transwell小室(購自美國Corning公司)檢測肺癌細胞的侵襲能力。將1∶4稀釋的Matrigel基質(zhì)膠100 μL加入到上室，待膠凝固后加入100 μL細胞懸液(細胞密度為3×105個/mL)，下室加入含血清的細胞培養(yǎng)液600 μL。將已轉(zhuǎn)染Delta-catenin質(zhì)粒24 h的腫瘤細胞接種到Matrigel基質(zhì)膠上繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后用預(yù)冷甲醇固定，并用棉簽擦掉微孔膜上表面未侵襲的腫瘤細胞，然后用蘇木精復(fù)染細胞核。顯微鏡下隨機計數(shù)5個高倍視野中侵襲到微孔膜下表面的細胞，然后取平均值作為該實驗組的平均侵襲細胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS for Windows 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以示，并采用t檢驗進行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1過表達Delta-catenin可以顯著抑制JNK通路的活性

為了探討Delta-catenin對MAPK通路蛋白中p38、JNK活性的影響，在肺癌細胞系SPC和SK中分別轉(zhuǎn)染pCMV5-FLAG/Delta-catenin質(zhì)粒后觀察p38、JNK蛋白及其各自磷酸化狀態(tài)的蛋白(即p-p38、p-JNK)表達水平是否改變。結(jié)果顯示，無論是p38還是p-p38蛋白水平在過表達Delta-catenin前后均沒有顯著變化(圖1A，P>0.05)。與此同時，JNK的總蛋白水平雖然沒有變化(圖1B，P>0.05)，但其磷酸化狀態(tài)蛋白p-JNK的表達水平卻顯著下降(圖1B，P<0.05)。無論是SPC細胞系還是SK細胞系均顯示了類似的蛋白表達結(jié)果。說明過表達Delta-catenin可以顯著降低JNK通路的活性。

圖1　　在SPC或SK細胞系中過表達Delta-catenin后p38、p-p38、JNK和p-JNK蛋白表達水平的變化Fig. 1 The alteration of p38, p-p38, JNK, p-JNK protein expressive level in SPC or SK cell lines with Delta-catenin overexpression

2.2過表達Delta-catenin顯著減少肺癌細胞的凋亡比例

為了探討Delta-catenin蛋白對肺癌細胞凋亡的影響。本研究采用流式細胞儀檢測不同實驗組腫瘤細胞凋亡比例的改變。在SPC細胞系中，過表達Delta-catenin后瘤細胞的平均凋亡比例顯著減少，為(3.03±0.68)%，而未轉(zhuǎn)染的細胞和轉(zhuǎn)染空載體的細胞凋亡比例分別為(19.49±0.88)%和(17.01±1.06)%，且過表達組與未轉(zhuǎn)染組或空載體組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與此類似，在SK細胞系中過表達Delta-catenin后瘤細胞的平均凋亡比例也顯著減少，為(2.15±0.47)%，而未轉(zhuǎn)染的細胞和轉(zhuǎn)染空載體的細胞凋亡比例分別為(6.97±0.92)%和(7.51±0.74)%，且過表達組與未轉(zhuǎn)染組或空載體組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2，P<0.05)。

2.3過表達Delta-catenin顯著增強肺癌細胞的侵襲能力

本研究采用Matrigel基質(zhì)膠侵襲實驗觀察了過表達Delta-catenin前后肺癌細胞侵襲能力的改變。在SK細胞系中，過表達Delta-catenin蛋白后穿過微孔膜的瘤細胞數(shù)量［(36.12±4.33)個］明顯多于未處理組［(15.00±3.78)個］和空載體對照組［(13.68±1.46)個］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同樣，在SPC細胞系中過表達Delta-catenin蛋白后穿過微孔膜的瘤細胞數(shù)量［(67.31±8.02)個］也顯著高于未處理組［(24.62±4.78)個］和空載體對照組［(22.89±2.39)個］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3，P<0.05)。

圖2　　在SPC和SK細胞系中過表達Delta-catenin后瘤細胞凋亡的變化Fig. 2 The apoptotic alteration of tumor cell in SPC and SK cell lines with Delta-catenin overexpression The percent number of upper figure means only one experiment; *: P<0.05, compared with pCMV-Delta-catenin group

圖3　　在SK和SPC細胞系中過表達Delta-catenin后瘤細胞侵襲數(shù)量的變化Fig. 3 The number alteration of invasive tumor cell in SK and SPC cell lines with Delta-catenin overexpression.

3　　討論

Delta-catenin蛋白的表達與惡性腫瘤之間的關(guān)系研究已有較多報道［2-5］。包括我們在食管癌中關(guān)于Delta-catenin表達的最新研究在內(nèi)［1］，Delta-catenin蛋白及基因表達水平在多個所研究的惡性腫瘤中表達都明顯增加，而且它的陽性表達與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，把Delta-catenin作為一個預(yù)測惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物標記物可能具有重要的臨床意義。然而，既然不久的將來可以把Deltacatenin作為臨床預(yù)測患者預(yù)后或判斷患者治療效果的腫瘤標記物來應(yīng)用，但是Delta-catenin促進腫瘤增殖侵襲的確切機制卻仍然不清楚，這也為Delta-catenin檢測的臨床推廣增加了難度。因此，在本研究中我們針對Delta-catenin可能的促癌機制進行了初步探討。

眾所周知，MAPK家族成員p38、JNK、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)在多種細胞生理和病理條件下發(fā)揮重要的作用，而其中的p38、JNK對于細胞凋亡的促進起主要影響［12］。本研究結(jié)果顯示，在肺癌細胞系中過表達Delta-catenin對p38及p-p38的表達水平并沒有影響，并且對JNK的表達也沒有影響，但卻顯著降低p-JNK的表達水平，而我們知道只有磷酸化的JNK才可以發(fā)揮細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。以上結(jié)果說明，Deltacatenin可以明顯降低JNK蛋白的活性，而我們知道JNK蛋白活性的增加是促進細胞凋亡的主要途徑，那么Delta-catenin是否可以通過降低JNK的活性而減少腫瘤細胞的凋亡呢？因此，我們借助流式細胞術(shù)觀察了過表達Delta-catenin后JNK蛋白活性下降的同時腫瘤細胞的凋亡是否明顯減少。與我們的猜測一致，過表達Delta-catenin后肺癌細胞的凋亡比例也顯著減少，而我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，過表達Delta-catenin可以促進肺癌細胞的增殖［5］，也就是說Delta-catenin可能通過抑制腫瘤細胞的凋亡而促進腫瘤細胞的增殖。此外，我們通過Matrigel基質(zhì)膠侵襲實驗發(fā)現(xiàn)過表達Delta-catenin還可以增強腫瘤細胞的侵襲能力。那么，結(jié)合本次研究結(jié)果得出，Deltacatenin高表達可能通過降低JNK通路的活性而導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡比例的下降并進而促進了瘤細胞的增殖，也進一步促進了腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，這也印證了我們之前關(guān)于Delta-catenin高表達與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)的結(jié)論。

總之，Delta-catenin促進腫瘤細胞惡性表型的機制可能比較復(fù)雜，因為我們之前的研究還顯示Delta-catenin可能通過改變小GTPases (包括RhoA、Cdc42和Rac1)的活性而促進細胞骨架的重新裝配，進而使腫瘤細胞的運動能力增強，也就促進了腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移［13］。所以，Delta-catenin可能通過多條通路來促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而且這些通路之間可能存在多處Crosstalk位點，如果我們今后能找到?jīng)Q定Delta-catenin多條信號傳遞通路的限制性位點，那么開發(fā)針對Delta-catenin的分子靶向藥物將會變得更加容易且高效。

［1］ ZHANG J Y, BAI C Y, BAI Y Q, et al. The expression of δ-catenin in esophageal squamous cell carcinoma and its correlations with prognosis of patients ［J］. Hum Pathol, 2014, 45(10): 2014-2022.

［2］ LU Q, DOBBS L J, GREGORY C W, et al. Increased expression of delta-catenin/neural plakophilin-related armadillo protein is associated with the down-regulation and redistribution of E-cadherin and p120ctn in human prostate cancer ［J］. Hum Pathol, 2005, 36(10): 1037-1048.

［3］ WANG M, DONG Q, ZHANG D, et al. Expression of deltacatenin is associated with progression of human astrocytoma［J］. BMC Cancer, 2011, 11: 514. doi: 10.1186/1471-2407-11-514.

［4］ FANG Y, LI Z, WANG X, et al. Expression and biological role of δ-catenin in human ovarian cancer ［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2012, 138(10): 1769-1776.

［5］ ZHANG J Y, WANG Y, ZHANG D, et al. Delta-catenin promotes malignant phenotype of non-small cell lung cancer by non-competitive binding to E-cadherin with p120ctn in cytoplasm ［J］. J Pathol, 2010, 222(1): 76-88.

［6］ BENHAR M, ENGELBERG D, LEVITZKI A. ROS, stressactivated kinases and stress signaling in cancer ［J］. EMBO Rep, 2002, 3(5): 420-425.

［7］ LEWIS T S, SHAPIRO P S, AHN N G. Signal transduction through MAP kinase cascades ［J］. Adv Cancer Res, 1998, 74: 49-139.

［8］ SHEN H M, LIU Z G. JNK signaling pathway is a key modulator in cell death mediated by reactive oxygen and nitrogen species ［J］. Free Radic Biol Med, 2006, 40(6): 928-939.

［9］ KYRIAKIS J M, AVRUCH J. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation ［J］. Physiol Rev, 2001, 81(2): 807-869.

［10］ EDBAUER D, CHENG D, BATTERTON M N, et al. Identification and characterization of neuronal mitogenactivated protein kinase substrates using a specific phosphomotif antibody ［J］. Mol Cell Proteomics, 2009, 8(4): 681-695.

［11］ FUJITA T, OKADA T, HAYASHI S, et al. δ-Catenin/ NPRAP (neural plakophilin-related armadillo repeat protein) interacts with and activates sphingosine kinase 1［J］. Biochem J, 2004, 382(Pt 2): 717-723.

［12］ YANG C B, PEI W J, ZHAO J, et al. Bornyl caffeate induces apoptosis in human breast cancer MCF-7 cells via the ROS-and JNK-mediated pathways ［J］. Acta Pharmcol Sin, 2014, 35 (1): 113-123.

［13］ 張俊毅, 董彩鳳, 劉曉輝, 等. NPRAP蛋白通過調(diào)節(jié)小GTP酶活性促進肺癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化［J］. 腫瘤, 2013, 33(6): 483-489.

Delta-catenin protein reduces apoptosis of lung cancer cells via inhibiting the activity of JNK pathway

DONG Caifeng1, SUN Lihong2, ZHANG Jian3, ZHANG Chaojun1, ZHANG Junyi4
(1.Department of Respiratory, the Affiliated Hospital of Chifeng University, Chifeng 024000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2.Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Chifeng University, Chifeng 024000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 3.Department of Pathology, People’s Hospital of Wuhai City, Wuhai 016000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 4.Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Chifeng University, Chifeng 024000, Inner Mongolia Autonomous Region, China)
Correspondence to: ZHANG Junyi E-mail: zhangjunyi77@sina.com

Background and purpose: As a member of the catenin family, Delta-catenin protein could promote proliferation and invasion of tumor cells, but the accurate mechanism of Delta-catenin promoting cell proliferation is not clear. In the present study, we illustrated that Delta-catenin’s effect on cell apoptosis and their relationship with mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, and the possible mechanism was also explored for Deltacatenin promoting invasion and proliferation of tumor cells. Methods: The alterations of p38 and c-jun N-terminal rinasel JNK protein activity were detected in SPC and SK lung cancer cell lines with Delta-catenin overexpression or not, by Western blot method. At the same time, the apoptotic number of tumor cells was also examined by FCM method. Furthermore, the number of invasive tumor cells was examined by Matrigel invasive experiment. Results: Compared with untreated group and empty vector group, the activity of p38 protein was unchanged in lung cancer cell lines with Delta-catenin overexpressed (P>0.05), but the activity of JNK protein was decreased significantly (P<0.05),meanwhile, apoptotic proportion of tumor cells were also reduced (P<0.05), and invasive ability of tumor cells was enhanced significantly (P<0.05). Conclusion: Delta-catenin probably decreases apoptosis number of lung cancer cells via inhibiting the activity of JNK pathway, and then promotes invasive ability of tumor cells.

Delta-catenin; Lung cancer; Cell apoptosis; c-jun N-terminal kinase pathway

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.004

R734.2

A

1007-3639(2016)11-0902-06

國家自然科學(xué)基金(81201844)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2014MS0869)；內(nèi)蒙古衛(wèi)計委醫(yī)療衛(wèi)生科研計劃項目(201303156)。

張俊毅E-mail：zhangjunyi77@sina.com

（2015-11-11

2016-03-07）