miR-31在結直腸癌患者血清中的表達及對結腸癌HCT116細胞增殖及凋亡的影響

王園園，張麗靜，韓曉東，翟叢劼，杜志堅，張　軍，趙增仁

河北醫科大學第一醫院普外科，河北 石家莊 050031

miR-31在結直腸癌患者血清中的表達及對結腸癌HCT116細胞增殖及凋亡的影響

王園園，張麗靜，韓曉東，翟叢劼，杜志堅，張軍，趙增仁

河北醫科大學第一醫院普外科，河北 石家莊 050031

背景與目的：microRNA與腫瘤關系密切，血清miRNAs可以作為篩選和監測結直腸癌的有效指標。該研究旨在檢測結直腸癌患者血清中miR-31的表達水平，并分析miR-31對結腸癌細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響。方法：收集40例結直腸癌患者和35例健康人群作為對照，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)，檢測其血清miR-31的表達水平，并分析結直腸癌患者血清miR-31的表達水平與臨床病理特征之間的關系。采用脂質體轉染將miR-31模擬物(miR-31 mimics)和抑制劑(miR-31 inhibitor)轉染到HCT116細胞，采用CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡及周期改變。結果：結直腸癌患者血清中miR-31的表達顯著高于健康對照組，miR-31表達與結直腸癌分化程度有關。轉染miR-31mimics組HCT116細胞生長增快，而轉染miR-31抑制劑后細胞增殖能力明顯降低(P＜0.01)；同時miR-31mimics組細胞凋亡所占比例較miR-31抑制劑組和陰性對照組(miR-control，NC)明顯減少，尤其是晚期凋亡細胞減少為著；轉染miR-31抑制劑組，G1期細胞較miR-31 mimics組和NC組明顯增多。結論：miR-31在結直腸癌患者血清中表達顯著上調，miR-31可能通過促進結腸癌細胞增殖、抑制細胞凋亡而參與了結直腸癌的發展進程，有望成為結直腸癌診斷的標志物。

大腸癌；microRNA-31(miR-31)；血清；細胞增殖；凋亡

結直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，早期可以通過手術取得很好的療效。由于大多數患者早期缺乏特異性癥狀和體征，患者就診時多數已處于中晚期。因此，臨床迫切需要尋找有效的方法在早期發現腫瘤。血漿miRNA作為一種非侵入性的腫瘤診斷和預后評價的標志物正顯示出良好的應用前景。本研究的前期研究結果顯示，通過miRNA芯片技術能發現在結直腸癌組織中miR-31的表達明顯上調。本研究旨在探討血清 miR-31的表達并分析miR-31對結腸癌細胞增殖及凋亡的影響。

1　　資料和方法

1.1研究對象

收集河北醫科大學附屬第一醫院普外科2011年1月—2012年6月原發性結直腸癌手術患者40例(經術后病理切片證實)的臨床資料，術前均未接受過放化療和生物治療。其中男性25例，女性15例，平均年齡64.2歲。同時收集35例同期年齡匹配的健康體檢人群的外周血，且證實無腫瘤病史，其中男性19例，女性16例；年齡37～78歲，平均年齡63.4歲。結直腸癌患者和健康查體人群的年齡和性別匹配(P>0.05)。所有樣本的采集均獲得參與者本人的知情同意，本研究獲得河北醫科大學第一醫院倫理委員會的批準。

1.2主要試劑

McCoys 5A培養液、胎牛血清購自美國Gibco公司。TRIzol LS、脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，miRNeasy迷你試劑盒購自美國Qiagen公司，Allin-One?miRNA qRT-PCR檢測試劑盒、miR-31及內參U6的引物均購自廣州復能基因有限公司。miR-31mimics、抑制劑及miR-對照購自廣州市銳博生物技術有限公司。細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)試劑購自同仁化學研究所；細胞凋亡檢測試劑盒(AnnexinⅤ-FITC)購自深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1RNA 的提取

200 μL低溫冷藏的血清，置于冰上融化，且充分混勻。加入3倍體積的TRIzol LS到樣本中，在震蕩器上充分混勻，室溫放置5～15 min進行變性處理(為了控制提取過程中樣本間的差異，在變性處理之后加入內參)。按等體積加入氯仿，震蕩器上充分混勻，室溫放置15 min，在4 ℃條件下，12 000×g離心15 min 抽提RNA。將上層水相迅速轉移到新管中，加入1.5倍體積的無水乙醇，兩者充分混勻。按照miRNeasy迷你試劑盒的操作手冊用吸附柱進行RNA的富集。

1.3.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)檢測血清miR-31的表達水平

取總RNA 0.5 μg進行逆轉錄反應，反應條件：37 ℃×60 min，85 ℃×5 min。取反轉錄產物cDNA 2 μL進行RTFQ-PCR反應。RTFQ-PCR按照All-in-One?miRNA qRT-PCR檢測試劑盒說明書操作，反應條件：95 ℃預變性10 min，然后按95 ℃×10 s，60 ℃×30 s，72 ℃×10 s，進行40個循環。反應體系及試劑用量均嚴格按照說明書進行。記錄每個標本的Ct值，miR-31的相對表達量用2-△CT法計算。其中ΔCt＝CtmiR-31-CtU6。

1.3.3細胞培養及轉染

細胞培養：人結腸癌HCT116細胞用含10%胎牛血清的McCoys 5A培養液于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養。根據細胞生長狀況每2～3 d更換新鮮培養液1次。當細胞融合率為70%～80%時，用胰蛋白酶消化并進行細胞傳代或收集細胞。

細胞轉染：收集處于對數生長期的HCT116細胞，重懸后接種于24孔板。然后采用LipofectamineTM2000將miR-31 mimics、抑制劑及miR-control轉染到HCT116細胞中。轉染后6 h，更換無血清培養液為新鮮完全培養液，繼續培養并進行后續實驗。

1.3.4CCK-8法檢測不同轉染組細胞的增殖能力

將不同轉染組(miR-31mimics組、抑制劑組及miR-對照組)HCT116細胞于轉染后24 h消化細胞，接種于96孔板，按照CCK-8說明書分別于接種96孔板后第1、2、3和4 天向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養箱中繼續培養1 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(D450nm)。以時間為橫坐標，D450nm為縱坐標繪制細胞生長曲線。每組設4個復孔，實驗重復3次。

1.3.5流式細胞術檢測不同轉染組細胞的凋亡

收集轉染48 h后各轉染組細胞，用預冷PBS液充分洗滌細胞2次。按照Annexin Ⅴ-FITC試劑盒提供的說明書進行溶液的配制，以250 μL結合緩沖液重懸細胞并使其濃度至2×105個/mL～5×105個/mL，取195 μL的細胞懸液加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻，間隔3 min后再加入10 μL濃度為20 μg/mL的碘化丙啶溶液，混勻后于室溫下避光溫育10 min，加入300 μL結合緩沖液，輕輕混勻后上流式細胞儀(BD Calibur，BD biosciences)進行檢測分析。

1.4統計學處理

采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析。計量數據以x±s 表示，組間比較采用t檢驗，多組數據之間的差異采用單因素方差分析；大腸癌臨床病理特征與miR-31表達水平(-ΔCt)之間的關系分析采用獨立樣本t檢驗或方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　　結果

2.1結直腸癌患者血清miR-31的表達

本研究收集了40例結直腸癌患者術前血清標本，同時收集了35例健康人群(其性別、年齡構成與結直腸癌患者差異無統計學意義)的血清標本進行miR-31檢測。結果發現，結直腸癌患者血清miR-31的表達顯著增加，結直腸癌患者血清miR-31的相對表達量中位數為0.005 87，健康人群miR-31相對表達量中位數為0.000 37，結直腸癌患者血清miR-31表達明顯高于正常健康人群，差異有統計學意義(P<0. 001，圖1)。

圖1　　結直腸癌和健康對照組血清miR-31的表達Fig. 1 Expression of serum miR-31 in colorectal cancer and the healthy control

2.2血清miR-31表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征之間的關系

血清miR-31表達和結直腸癌臨床病理特征間的關系見表1。miR-31在不同臨床分期，其表達水平不同。隨著病情進展，血清miR-31有增高趨勢，Ⅲ期miR-31的表達較Ⅰ期和Ⅱ期增高，但是差異無統計學意義(P>0.05)。在低分化結直腸癌中血清miR-31表達水平較高分化腺癌增高約2倍，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1　結直腸癌患者血清miR-31與臨床病理指標關系Tab. 1 Relationship between the expression of serum miR-31 and clinicopathological features of colorectal carcinoma

2.3miR-31對結腸癌HCT116細胞增殖活性的影響

使用CCK-8檢測不同組別HCT116細胞在不同時間點的細胞生長情況。結果發現，轉染miR-31mimics組與miR對照組相比，細胞生長活力增加，而轉染miR-31抑制劑組細胞生長活力顯著降低(P<0.01，圖2)。

2.4miR-31對結腸癌HCT116細胞凋亡的影響

本研究采用流式細胞術檢測不同組別HCT116細胞凋亡情況。結果顯示，miR-31mimics組HCT116細胞的早期凋亡細胞所占比例為(1.80±0.73)%，晚期凋亡細胞為(6.01±0.61)%，活細胞數為(91.72±1.26)%；miR-31抑制劑組早期凋亡細胞為(3.31±0.38)%，晚期凋亡細胞所占比例為(14.19±2.72)%，活細胞數為(77.92±1.94)%；miR對照組早期凋亡細胞為(3.69±0.12)%，晚期凋亡細胞所占比例為(15.25±2.62)%，活細胞數為(75.06±1.88)%。3組之間早期凋亡細胞差異無統計學意義(P>0.05)，而晚期凋亡細胞差異無統計學意義(P>0.05)。miR-31mimics組晚期凋亡細胞較miR-31抑制劑組及miR對照組明顯減少，而miR-31抑制劑組和miR對照組相比差異無統計學意義(P>0.05，圖3)。

圖2　　miR-31 對細胞增殖的影響Fig. 2 Effects of miR-31 on cell proliferation

圖3　　miR-31對細胞凋亡的影響Fig. 3 Effects of miR-31 on cell apoptosis The miR-31 mimics compared with miR-31 inhibitor, P<0.05; The miR-31 mimics compared with negative control, P<0.05

2.5miR-31對結腸癌HCT116細胞周期的影響

采用流式細胞術檢測不同組別HCT116細胞周期分布情況。結果顯示，miR-31抑制劑組G1期細胞較miR-31 mimics和miR對照組細胞明顯增多，S期細胞明顯減少(P<0.05，圖4)。

圖 4　miR-31對細胞周期的影響Fig. 4 Effects of miR-31 on cell cycle distribution The miR-31 mimics compared with miR-31 inhibitor, P＜0.05; miR-31 inhibitor compared with negative control, P＜0.05

3　　討論

microRNA(miRNA)是一類長18～22 nt的單鏈非編碼RNA，通過特異性識別并結合靶mRNA的3’-UTR區，促進靶mRNA降解和(或)阻礙翻譯過程而發揮作用［1］。越來越多的證據表明，miRNA參與多種腫瘤發生、發展的多個環節，如結直腸癌中miR-139-5p低表達，且與腫瘤細胞增殖、浸潤與轉移有關［2］。本課題組前期采用miRNA芯片篩選發現，miR-31在結直腸癌組織中表達增加［3］，提示miR-31可能與結直腸癌的發生、發展有關。

人miR-31首先在HeLa細胞中被發現，研究證實，miR-31在多種惡性腫瘤中表達異常且存在組織差異性。有研究表明，其可以作為癌基因(oncomiR)，如miR-31通過調控LATS2和PPP2R2A導致肺癌細胞生長加快［4］；miR-31可以通過阻抗或抑制缺氧誘導因子增加頭頸鱗癌細胞的進展［5］；在結直腸癌，miR-31通過激活RAS信號通路，通過抑制RASA1翻譯，增加結腸癌細胞生長，促進腫瘤生成［6］。相反，miR-31也可作為腫瘤抑制因子，如miR-31表達和乳腺癌的轉移呈負相關，miR-31通過介導的ITGA5、RDX和RhoA抑制乳腺癌轉移［7］。miR-31通過調控細胞周期關鍵蛋白如E2F1、E2F2、FOXM1和MCM2等破壞細胞穩態，導致前列腺癌的發生、發展［8］。另外有學者研究發現，miR-31作為一個腫瘤抑制因子，通過直接調控HDAC2和CDK2表達抑制肝癌細胞生長和轉移［9］。

miR-31在結直腸癌中高表達，且能促進腫瘤生長提示miR-31可能是一種腫瘤標志物。許多研究表明，腫瘤患者血液中可檢測到miRNA異常表達［10-11］。食管鱗癌患者血清miR-31的表達較正常對照組明顯增高，且高表達miR-31者，無瘤生存期和總生存期均縮短［12］。另有學者檢測了結直腸癌患者血清中包括miR-31在內的6個miRNA(包括miR-21、let-7g、miR-31、miR-92a、miR-181b和miR-203)的表達，證實在結直腸患者和正常對照組有顯著差異，且其表達和結直腸癌的進展有關，而且同時檢測這6種miRNA可以很好的區分結直腸癌患者和非患者，其靈敏度和特異度分別高達90%和92.3%［13］。

本實驗結果發現，結直腸癌患者血清miR-31表達明顯高于正常健康人群，并且在低分化腺癌中的表達水平高于高分化腺癌，提示miR-31可能參與了結直腸癌的進展過程。另外本研究發現，隨著腫瘤分期升級，血清miR-31的表達有增高的趨勢，差異無統計學意義，分析其原因可能與我們納入研究的樣本量太少有關。

同時，本研究將人工合成的miR-31mimics和抑制劑轉染人結腸癌HCT116細胞，體外細胞實驗初步研究了miR-31的功能。結果證實，miR-31過表達組細胞生長明顯增快，且細胞凋亡減少；抑制miR-31表達可以降低細胞活力，同時可以誘導細胞凋亡增加，導致細胞周期阻滯。細胞生長和侵襲是腫瘤細胞的重要特征，抑制細胞生長可以有效阻止腫瘤進展。

本實驗不足之處是需要加大研究的樣本量，同時可以聯合其他miRNA檢測，分析其聯合表達與結直腸癌臨床病理資料間的關系，同時分析其用于結直腸癌診斷的靈敏性和特異性，以將其用于臨床，對結直腸癌患者的早期、無創診斷提供更好的參考價值。

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Expression of serum miR-31 in colorectal cancer patients and its effect on cell proliferation and apoptosis

WANG Yuanyuan, ZHANG Lijing, HAN Xiaodong, ZHAI Congjie, DU Zhijian, ZHANG Jun,ZHAO Zengren

(Department of General Surgery, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China)
Correspondence to: ZHAO Zengren E-mail: zzr-doctor@163.com

Background and purpose: miRNA plays important roles in tumorigenesis. It has been reported that many kinds of serum miRNA serve as markers for tumor diagnosis and screening. This study aimed to detect the expression of serum miRNA-31 (miR-31) in colorectal cancer patients and to explore the effect of miR-31 on cell proliferation, apoptosis and cell cycle distribution. Methods: The expressions of miR-31 in 40 cases of colorectal cancer serum and 35 cases of the healthy control were examined by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR). The correlation between miR-31 expression and clinicopathological features of colorectal cancer (including age, gender, depth of infiltration, lymph node metastasis, clinical stage) were further analyzed. The miR-31 mimics, inhibitor and miR-control (negative control) were transfected into HCT116 cells. The effect of miR-31 on cell proliferation was evaluated by CCK-8 method. Flow cytometry was used to examine the change of cell apoptosis and cell cycle. Results: Relative expression of serum miR-31 was significantly increased in cancer patients compared with healthy controls (P<0.01). Expression of serum miR-31 was higher in poorly differentiated carcinoma than that in well or moderately differentiated carcinoma (P<0.05). No correlation was found between serum miR-31 expression and otherclinicopathological variables. CCK-8 assay showed that after transfection with miR-31 mimics, the cell proliferation was increased, compared with miR-31 inhibitor and negative control group. Meantime, the apoptotic cell number was significantly decreased, particularly in late apoptosis. The cell number of G1stage was remarkably increased in miR-31 inhibitor group, compared with miR-31mimics and negative control group. Conclusion: The expression of serum miR-31 is higher in colorectal cancer. miR-31 can promote cell proliferation and inhibit the apoptosis of HCT116 cells. It might be a potential biomarker for colorectal cancer.

Colorectal cancer; miRNA-31(miR-31); Serum; Cell proliferation; Apoptosis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.002

R735.3

A

1007-3639(2016)11-0888-06

國家自然科學基金項目(81072034)；河北省衛生廳項目(20110284)。

趙增仁E-mail：zzr-doctor@163.com

（2015-07-30

2016-01-15）