建立符合人類診斷標準的變應性鼻炎大鼠模型初探*

周柳青，劉勇強，張小兵

（1.蘭州大學第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學基礎醫學院人體解剖學研究所，甘肅蘭州730000）

建立符合人類診斷標準的變應性鼻炎大鼠模型初探*

周柳青1，劉勇強2，張小兵1

（1.蘭州大學第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學基礎醫學院人體解剖學研究所，甘肅蘭州730000）

建立符合人類診斷標準的變應性鼻炎大鼠模型。取6-8周齡的Wistar大鼠27只，雌雄各半，隨機分為模型組（n=12）和對照組（n=12），另有3只空白大鼠用于被動皮膚過敏試驗（PCA）。模型組以卵清蛋白（OVA）作為變應原輔以氫氧化鋁佐劑進行腹腔注射，完成基礎致敏；之后用2%OVA生理鹽水進行鼻內激發。對照組以生理鹽水替代OVA。模型組基礎致敏階段完成后，PCA（+），證明IgE產生；鼻內激發階段完成后，各大鼠行為學評分均>5分，出現噴嚏、鼻癢、流清涕等典型癥狀，鼻粘膜病理切片HE染色示嗜酸性粒細胞浸潤。對照組無上述變化。本實驗成功建立了符合人類診斷標準的可重復的變應性鼻炎大鼠模型。

耳鼻咽喉頭頸外科；變應性鼻炎；大鼠模型；IgE；嗜酸性粒細胞

近年來變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）患病率直線上升，全球患者超過5億，圍繞其預防、診療所開展的科學研究成為熱點[1]。AR是一種發生在鼻粘膜的I型變態反應疾病，其診斷要點為發作時典型的臨床癥狀、IgE抗體陽性和鼻粘膜嗜酸性粒細胞浸潤[2]。此次，我們設計并建立了符合以上診斷標準的AR大鼠模型，通過行為學再現了AR發作時的典型臨床癥狀[3]，使用PCA試驗說明了IgE抗體陽性[4]，通過鼻粘膜病理切片HE染色展示了嗜酸性粒細胞浸潤[5]。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

1.1.1 實驗動物及分組

6～8周齡Wistar大鼠 （蘭州大學實驗動物中心提供），共27只，雌雄各半，體重180～220g，SPF級。在清潔空調動物房飼養，避免常見過敏原存在，早晚12h間斷照明。隨機分為兩組，每組12只。第1組為模型組；第2組為對照組。另有3只空白大鼠用于被動皮膚過敏試驗 （passive cutaneous anaphylaxis reaction,PCA）。

1.1.2 藥品與試劑

卵白蛋白（ovalbumin，OVA，美國Sigma公司，V級）。氫氧化鋁佐劑制備：AlCl3+3NaOH=Al(OH)3↓+ 3NaCl。反應產物經過反復混勻、抽吸和洗滌后得到新鮮配制的膠態氫氧化鋁[6]。

1.2 造模方法

1.2.1 基礎致敏

模型組：0.3mgOVA+1mlAl(OH)3佐劑，腹腔注射，隔日1次，共7次。對照組：1mL生理鹽水+ 1mLAl(OH)3佐劑，腹腔注射，隔日1次，共7次。

1.2.2 鼻內激發

基礎致敏階段末次腹腔注射結束后隔日開始鼻內激發階段。模型組：每日每側鼻腔滴入2%OVA生理鹽水20ul，連續10d。對照組：每日每側鼻腔滴入生理鹽水20ul，連續10d。

1.3 模型評價項目

1.3.1 行為學觀察

激發后即刻至30min內，用數碼攝像對大鼠行為進行記錄，觀察動物撓鼻、噴嚏、流涕癥狀。評分標準見表1[3，7]。

表1 變應性鼻炎大鼠

1.3.2 PCA反應

血清制備：基礎致敏完成后，自模型組和對照組中隨機各取3只大鼠，脫毛開胸心臟采血約5mL。血液樣本于4℃保存2～4h，隨后離心（3000 rpm，4℃）以獲得血清。

另取空白大鼠3只，麻醉后脫毛，背部皮下分4個區域，每個區域1個注射點，每點間隔大于2cm。將所制備的各組血清原液，分別皮內注射于相應空白大鼠背部皮膚，0.1mL/點。7h后尾靜脈注射含有相同致敏劑量的抗原和伊文思藍（Evans Blue，北京索萊寶科技有限公司）等量混合液，共1mL。30min后處死大鼠，剝離背部皮膚，測量藍斑直徑，直徑大于5mm者判斷為陽性[8]。

1.3.3 組織病理學評價

鼻標本提取：末次激發1h后，各組大鼠以10%水合氯醛300mg/kg行腹腔注射。麻醉后取鼻中隔粘膜固定于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋，制成4um厚切片。石蠟切片常規脫蠟入水后做HE染色，用以觀察鼻粘膜的嗜酸性粒細胞浸潤等組織病理學改變。

1.4 統計學分析

計數結果以 “均數±標準差”表示，應用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析進行組件比較，采用q檢驗進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學評分

每次鼻內激發后，模型組動物均出現頻繁撓鼻、噴嚏及流水樣涕，每只的疊加量化評分都大于5分，平均評分為（7.6±0.7）。對照組大鼠激發后，偶有撓鼻，無其他上述癥狀，疊加量化評分為（1.9±1.3）。兩組的行為學評分比較有統計學差異（P<0.05）。

2.2 PCA反應

模型組PCA反應（+），對照組PCA反應（-）

2.3 HE染色

模型組中除去PCA試驗已用去的3只大鼠，剩余9只中有3只可見鼻粘膜嗜酸性粒細胞增多，杯狀細胞增多，部分粘膜上皮脫落（如圖1所示）。對照組鼻粘膜均未見嗜酸性粒細胞及杯狀細胞增多，粘膜上皮排列整齊。

圖1 鼻粘膜HE染色（40×）模型組鼻粘膜大量嗜酸性粒細胞增多，杯狀細胞增多,部分粘膜上皮脫落

3 討論

目前國內外復制、評價AR動物模型尚無統一標準[9]。Wistar大鼠是常見的模型動物，通常以OVA作為變應原致敏，所建的AR模型常以行為學評分作為評價標準，不夠客觀[10，11]。因此嘗試建立了此模型，并用人類的AR診斷標準對其進行了初步評價。

AR是機體暴露于變應原后主要由IgE介導的鼻粘膜非感染性慢性炎性疾病，其確診需要檢測針對變應原（與病人病史有關的）的IgE反應或檢測血清中的 IgE，臨床常用的方法有皮膚針刺試驗(skinpricktest，SPT)[12]。本試驗采用PCA反應作為檢測IgE的手段，其原理與SPT相同，都是利用抗原與注射部位的肥大細胞上的抗體起反應，導致組胺釋放而出現局部過敏反應。因此可準確的判斷出I型變態反應的標志IgE的產生。

嗜酸性粒細胞升高是人類AR診斷的重要客觀指標[13-14]常使用無創的鼻分泌物涂片為手段，在高倍顯微鏡下觀察嗜酸性粒細胞比例>5%作為診斷標準。由于大鼠鼻腔容積小，提取鼻分泌物較困難，因此我們選用經典的病理學診斷方法——鼻粘膜病理切片HE染色，來評價鼻粘膜嗜酸性粒細胞的變化。經過與對照組比較，清晰的觀察到模型組鼻粘膜嗜酸性粒細胞增多，從而作出AR的診斷，這也是臨床上最為可靠、常用的診斷方法。

參閱以往關于建立變應性鼻炎動物模型的文獻，此次研究以人類變應性鼻炎診斷標準為依據，在Wistar大鼠上再現了變應性鼻炎發作時的臨床癥狀及診斷指標--IgE和嗜酸性粒細胞增高，且所選用的評價手段簡便易行、成本低廉、可操作性及特異性好，但成模率仍有待提高。

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R246.81

國家自然科學基金資助項目（81160449）。