不同中藥復方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響

張 洋，張 艷，張 紅

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·論著·

· 中醫·中西醫結合研究·

不同中藥復方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響

張 洋，張 艷，張 紅

目的 觀察不同中藥復方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響。方法 2010年4月—2011年1月，以冠狀動脈結扎配合力竭式游泳的方法造成心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，分為模型組、西藥組、益氣組、活血組、益氣活血組，另設空白對照組。每組10只大鼠。采用實時熒光定量PCR及免疫組化檢測心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達。結果 實時熒光定量PCR和免疫組化結果均顯示：與空白對照組比較,模型組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達下降(P<0.05)；與模型組比較,各給藥組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達升高(P<0.05)；西藥組、益氣活血組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達高于益氣組及活血組(P<0.05)。結論 益氣活血中藥復方較益氣中藥復方、活血中藥復方更能提高心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，可達到治療心力衰竭的作用。

益氣活血；心力衰竭 ；心肌梗死；膠原Ⅰ型；膠原Ⅲ型

張洋，張艷，張紅.不同中藥復方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響[J].中國全科醫學，2016，19(36)：4509-4514.[www.chinagp.net]

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心力衰竭是各種心血管疾病發展的終末階段，其發病率、致殘率及病死率均較高，心力衰竭已成為心血管疾病的主要死亡原因。心肌梗死后心室重構是心力衰竭發生發展的重要病理生理基礎[1]。臨床觀察發現，益氣活血中藥能夠改善心力衰竭患者臨床癥狀、降低死亡率，并延緩心力衰竭進程[2]。祖國醫學認為，氣虛血瘀是心力衰竭發生、發展的重要機制，故益氣活血法為治療心力衰竭的有效治則。目前鮮見不同中藥復方對心肌梗死后心力衰竭影響的相關研究。本研究通過觀察不同中藥復方，即益氣中藥復方、活血中藥復方、益氣活血中藥復方對心肌梗死后心力衰竭大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的影響，從中篩選出療效較好的中藥復方，探討其對心室重構的影響，為中醫藥防治心力衰竭提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗所需動物由遼寧長生生物技術有限公司提供〔SCXK(遼)2010-0001〕。選用12周齡普通級健康雄性SD大鼠100只，體質量220～260 g。動物飼養環境為遼寧中醫藥大學實驗動物中心。

本文創新點：

(1)方法創新：通過對大鼠冠狀動脈結扎及配合力竭式游泳的方法，成功制造了心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，通過活血中藥復方、益氣中藥復方及益氣活血中藥復方進行干預，從中篩選出療效突出的中藥復方。(2)思路創新：本研究融合了中醫辨證論治理論，進一步證實了“益氣活血”治則在治療心力衰竭中的重要作用。

1.2 造模與分組 實驗時間2010年4月—2011年1月。隨機選取10只未予任何處理的大鼠為空白對照組。90只大鼠經1周適應性喂養后采用2%戊巴比妥鈉溶液，按48 mg/kg劑量行腹腔注射麻醉。胸部備皮，將針形電極刺入大鼠四肢及胸壁皮下，連接超聲心電圖機，記錄心電圖(見圖1)。于左側第4肋間開胸，鈍性分離胸部肌肉，暴露肋骨，鈍性分離肋骨間肌肉組織，過程中注意保護肺臟，撥開胸腺，眼科鑷撕開心包膜，于左冠狀動脈前降支起點2 mm處用6-0號線結扎冠狀動脈前降支[3-4]。心臟表面給予利多卡因注射液0.1 ml以預防室性心律失常的發生[5]，重置心臟于胸腔，分層縫合胸壁。術后心電圖表現為ST段抬高或出現病理性Q波判定為發生心肌梗死(見圖2)。術后連續注射青霉素鈉3 d，以預防感染。常規喂養1周后將飼料減半，同時每日游泳至其力竭(把大鼠置于長2.0 m、寬1.5 m的水池中，水深約1.0 m，以大鼠頭部完全沉入水中，肢體無明顯擺動判斷為力竭)，1次/d，共4周[6-7]。再次行超聲心動圖檢測大鼠射血分數(EF)(見圖3、4)，計算心臟指數(CI)；以EF≤60%或CI≤180 ml·min-1·kg-1作為心力衰竭成功造模的標準[8-9]。將造模成功的54只大鼠按照隨機數字表法分為模型組、西藥組、益氣組、活血組及益氣活血組每組各10只大鼠，4只造模成功的大鼠退出本研究。

注：心率419次/min，最大值0.21 mV，最小值-0.06 mV，峰值0.28 mV

圖1 冠狀動脈結扎術前大鼠心電圖

Figure 1 The rat electrocardiogram before operation

注：心率392次/min，最大值0.24 mV，最小值-0.40 mV，峰值0.64 mV

圖2 冠狀動脈結扎術后大鼠心電圖

Figure 2 The rat electrocardiogram after operation

圖3 空白對照組大鼠超聲心動圖

圖4 術后行力竭式游泳4周大鼠超聲心動圖

Figure 4 Echocardiography of rat after operation and swimming exhaustion 4 weeks

1.3 藥物與給藥劑量 空白對照組與模型組蒸餾水灌胃1.5 ml/次，2次/d。西藥組藥物為賴諾普利片(10 mg/片)，產自信誼萬象藥業。益氣組藥物由黃芪、人參兩味中藥組成；活血組藥物由丹參、三七粉、益母草組成；益氣活血組藥物由黃芪、人參、丹參、三七粉、益母草組成；由天江藥業有限公司提供上述中藥復方制劑；處方中藥符合2010年版《中國藥典》相關中藥藥材質量檢驗規定標準[10]。各給藥組大鼠按人鼠劑量換算，給藥劑量(g/kg)=人的劑量(g)×系數(0.018)/所求動物體質量(kg)[11]。西藥組，1.5 mg生藥·kg-1·d-1，2次/d；益氣組、活血組、益氣活血組，9.2 g生藥·kg-1·d-1，2次/d[12-13]。6組均灌胃6周。

1.4 檢測方法 灌胃6周后處死全部大鼠，取其心肌組織；每只大鼠心臟按標準處理后分成2份，每份80 mg心肌組織。第1份用于實時熒光定量PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，采用SABC法進行染色(嚴格按試劑盒說明步驟操作)，第2份用于免疫組化檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(采用Image-Pro Plus 4.0圖像分析軟件進行結果分析)。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR和免疫組化檢測 各組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原實時熒光定量PCR溶解曲線及擴增曲線見圖5～8。各組Ⅰ、Ⅲ型膠原的溶解曲線均有較尖銳的峰，說明擴增產物穩定，數據可以采用。

實時熒光定量PCR和免疫組化結果均顯示：與空白對照組比較,模型組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達下降(P<0.05)；與模型組比較,各給藥組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達升高(P<0.05)；西藥組、益氣活血組大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原表達高于益氣組及活血組(P<0.05，見表1、2)。

圖5 Ⅰ型膠原溶解曲線

圖6 Ⅰ型膠原擴增曲線

圖7 Ⅲ型膠原溶解曲線

圖8 Ⅲ型膠原擴增曲線

Table 1 Expression results ofⅠ,Ⅲ type collagen detected by real time fluoresconce guantitative PCR in each group rats

組別只數Ⅰ型膠原Ⅲ型膠原空白對照組10100±000100±000模型組10053±003a061±002a西藥組10096±003b098±002b益氣組10078±003bc083±002bc活血組10079±002bc085±002bc益氣活血組10095±003bde097±002bdeF值23722253P值<005<005

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05；與益氣組比較，dP<0.05；與活血組比較，eP<0.05

2.2 心肌組織免疫組化法染色 Ⅰ、Ⅲ型膠原在心肌纖維橫紋中呈棕色顆粒為陽性。空白對照組心肌纖維橫紋中Ⅰ、Ⅲ型膠原的分布均勻、清晰。模型組Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達較空白對照組明顯減少；西藥組、活血組、益氣組及益氣活血組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達較模型組明顯增多；西藥組、益氣活血組Ⅰ、Ⅲ型膠原表達較益氣組、活血組增多(見圖9、10，本文圖9、10彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

Table2ExpressionresultsofⅠ,Ⅲtypecollagenimmunohistochemistryineachgrouprats

組別只數Ⅰ型膠原Ⅲ型膠原 空白對照組10486±50120±20模型組1047±7a60±19a西藥組10461±49b105±20b益氣組10339±37bc86±19bc活血組10341±38bc88±19bc益氣活血組10458±50bde102±21bdeF值29761524P值<005<005

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05；與益氣組比較，dP<0.05；與活血組比較，eP<0.05

3 討論

唐·孫思邈在《備急千金要方·心臟門》中首次提出“心衰”這一病名，“心衰則伏……”。宋·趙佶在《圣濟總錄·心臟門》中提出：“心衰則健忘，不足則胸腹脅下與腰背引痛……”。現代醫學的心力衰竭與中醫文獻記載的“心衰”尚存在著一定差異，屬于中醫學“胸痹”“水腫”“喘證”“心悸”等范疇[14]。其病機之根為陽微陰弦本虛標實之證候，本虛以氣虛為主，標實則以血瘀為重。因氣虛血瘀之證候貫穿于心力衰竭發展始末，故益氣活血為心力衰竭基本治則[15]。

圖9 各組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原免疫組化染色 (SABC法，×40)

圖10 各組大鼠心肌組織Ⅲ型膠原免疫組化染色 (SABC法，×40)

心室重構引起的心肌結構和功能的改變是心力衰竭發生發展的核心機制。心肌梗死所導致心肌膠原代謝異常的心室重構是心肌梗死后心力衰竭的病理生理基礎。生理情況下,Ⅰ、Ⅲ型膠原構成心肌膠原網絡支架(Ⅰ型膠原約占心肌膠原總含量80%，Ⅲ型膠原約占11%),在保護心肌細胞、維持心臟構型和僵硬度等方面起著十分重要的作用[16]。心肌膠原的過度沉積可促使心肌膠原的分布及含量發生改變，即各型膠原比例失調(主要為Ⅰ、Ⅲ型膠原比例失衡)，心肌細胞結構排列紊亂，病理性心肌重構使心功能進行性惡化，最終導致心力衰竭[17]。心肌膠原含量減少也可引起心肌細胞退化，細胞排列紊亂，甚至引起心肌肌纖維斷裂；表現為心肌彈性、抗牽拉性及左室舒張減退，從而導致心臟每搏輸出量及EF下降，進而加快心室重構和心力衰竭進程[18]。

本實驗通過對大鼠冠狀動脈結扎及配合力竭式游泳的方法導致心脈氣虛血瘀，成功營造了大鼠心肌梗死后心力衰竭(胸痹)模型，予益氣活血中藥進行干預。采用實時熒光定量PCR及免疫組化法檢測大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達。本研究發現，與模型組比較，西藥組、益氣組、活血組、益氣活血組大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達明顯升高；其中益氣活血組與西藥組效果相當，二者效果優于益氣組及活血組。本研究提示3種中藥復方均可改善心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達，效果以益氣活血組最為明顯。以黃芪、人參、丹參、三七粉、益母草為主要功效的益氣活血中藥中，黃芪、人參益氣通陽，丹參、三七粉、益母草活血化瘀通脈；諸藥合用，可達益氣活血，化瘀通脈之功效。本研究表明，益氣活血中藥配伍后在治療心力衰竭過程中起到了促進協同作用，為“氣旺以促血行”的配伍理論提供了科學客觀的實驗依據，佐證了“益氣活血”治則在治療心力衰竭中的重要意義。其作用機制可能是通過調節心肌膠原的分布及代謝，修復受損心肌組織，增強心肌的抗牽拉性、彈性，從而提高心肌整體收縮力，抑制心室重構，達到治療心力衰竭的作用。

作者貢獻：張洋進行實驗設計與實施、撰寫論文并對文章負責；張艷進質量控制及校審；張紅進行評估、資料收集整理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：趙躍翠)

Effect of Different Chinese Herbal Compound on Type Ⅰ,Ⅲ Collagen in Myocardium of Rats with Heart Failure Following Myocardial Infarction

ZHANG Yang，ZHANG Yan，ZHANG Hong.

Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032，China

ZHANG Yan，the Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;E-mail:95194031@qq.com

Objective To observe the effect of different Chinese herbal compound on type Ⅰ,Ⅲ collagen in myocardium of rats with heart failure following myocardial infarction.Methods From April 2010 to January 2011,the rat model of heart failure following myocardial infarction were established by coronary artery ligation method and exhaustive swimming.The experimental rats were divided into model group,western medicine group,Reinforcing qi group,Activating blood group,Reinforcing qi and activating blood group,and control group.10 rats in each group.Real time fluorescence quantitative PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in the myocardium of rats with heart failure following myocardial infarction.Results Compared with control group,the expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in model group detected by PCR and immunohistochemistry significantly decreased (P<0.05).Compared with model group,the expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in each treatment groups detected by PCR and immunohistochemistry significantly increased (P<0.05).The expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in western medicine group and Reinforcing qi and Activating blood group detected by PCR and immunohistochemistry were significantly higher than Reinforcing qi group and Activating blood group (P<0.05).Conclusion Reinforcing qi and activating blood Chinese herbal compound can improve the expression of type Ⅰ,Ⅲ collagen in myocardium of rats with heart failure following myocardial infarction,thus achieve the role of treatment of heart failure.

Reinforcing qi activat blood;Heart failure；Myocardial infarction；Collagen type I；Collagen type Ⅲ

110032 遼寧省沈陽市，遼寧中醫藥大學(張洋)；遼寧中醫藥大學附屬醫院(張艷)；大連醫科大學附屬第二醫院中醫理療科(張紅)

張艷，110032遼寧省沈陽市,遼寧中醫藥大學附屬醫院；E-mail:95194031@qq.com

R 541.6

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.36.021

2016-06-20；

2016-11-05)