自噬在尿毒癥小鼠心肌細(xì)胞損傷中的作用研究

龔建光，金 娟，趙 黎，林 波，梁世凱，何 強(qiáng)，李一文

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·論著·

自噬在尿毒癥小鼠心肌細(xì)胞損傷中的作用研究

龔建光，金 娟，趙 黎，林 波，梁世凱，何 強(qiáng)，李一文

目的 探討自噬與尿毒癥小鼠心肌細(xì)胞損傷的關(guān)系及其發(fā)生的可能機(jī)制。方法 2015年8—12月選取SPF級(jí)C57BL/6-PAX6雄性小鼠50只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分成對(duì)照組(6只)、假手術(shù)組(8只)、實(shí)驗(yàn)組〔5/6NC組(6只)、5/6NC+生理鹽水組(10只)、5/6NC+渥曼青霉素組(10只)以及5/6NC+Beclin-1組(10只)〕。對(duì)照組研究過(guò)程中不做任何干預(yù)。假手術(shù)組僅與實(shí)驗(yàn)組同期進(jìn)行兩次手術(shù)，但不切除腎臟。實(shí)驗(yàn)組制備5/6腎切除尿毒癥小鼠模型。造模6周時(shí)，5/6NC組不進(jìn)行干預(yù)，5/6NC+生理鹽水組、5/6NC+渥曼青霉素組、5/6NC+Beclin-1組分別給以0.9%氯化鈉溶液1 ml 腹腔內(nèi)注射，隔日1次；渥曼青霉素1 mg·kg-1·次-1，腹腔內(nèi)注射，1次/d；腺病毒攜帶的Beclin-1 1×109pfu腿部肌肉注射，1次/只。造模12周時(shí)采用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組小鼠心功能，ELISA法檢測(cè)肌酐、尿素氮，采用免疫組化及Western blotting法檢測(cè)處死后小鼠的心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 造模12周時(shí)，與對(duì)照組及假手術(shù)組比較，5/6NC組、5/6NC+生理鹽水組左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)增厚、左心室短軸縮短率(LVFS)降低，肌酐及尿素氮上升(P<0.05)；與5/6NC+生理鹽水組比較，與5/6NC+渥曼青霉素組LVEDD降低，LVFS升高，肌酐、尿素氮降低(P<0.05)；與對(duì)照組、5/6NC+生理鹽水組比較，5/6NC+Beclin-1組LVEDD增加，LVFS降低，肌酐及尿素氮升高(P<0.05)。免疫組化染色顯示5/6NC組心肌細(xì)胞Atg5、Cathepsin-D、Rab 7表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)；對(duì)照組與5/6NC組Atg5、Cathepsin-D、Rab 7陽(yáng)性細(xì)胞率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5/6NC+生理鹽水組、5/6NC+Beclin-1組心肌組織細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1及AKT表達(dá)均較對(duì)照組升高(P<0.05)，5/6NC+渥曼青霉素組LC3、Beclin-1及AKT表達(dá)雖較對(duì)照組升高，但低于5/6NC+生理鹽水組、5/6NC+Beclin-1組(P<0.05)，5/6NC+Beclin-1組LC3、Beclin-1、AKT表達(dá)較5/6NC+生理鹽水和5/6NC+渥曼青霉素組升高(P<0.05)。結(jié)論 尿毒癥小鼠心肌細(xì)胞的損傷與自噬密切相關(guān)，增強(qiáng)或抑制自噬可以加重或緩解尿毒癥小鼠心腎功能，Beclin-1基因及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號(hào)蛋白在調(diào)節(jié)尿毒癥心肌細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用。

心肌疾病；尿毒癥；自噬；自噬相關(guān)蛋白；PI3K/AKT信號(hào)蛋白

龔建光，金娟，趙黎，等.自噬在尿毒癥小鼠心肌細(xì)胞損傷中的作用研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(36)：4489-4494.[www.chinagp.net]

GONG J G,JIN J,ZHAO L,et al.Effect of autophagy on cardiac myocytes injury in uremic cardiomyopathy mice[J].Chinese General Practice，2016，19(36)：4489-4494.

尿毒癥患者的心血管疾病(CVD) 是一個(gè)重要的臨床問(wèn)題,是尿毒癥患者的首要死亡原因。有調(diào)查顯示，我國(guó)慢性腎臟病1～5期患者CVD發(fā)生率分別為1.28%、17.24%、22.86%、33.33%、56.20%；維持性血液透析治療的慢性腎臟病5期患者CVD發(fā)生率高達(dá)78.51%[1]。尿毒癥CVD主要為尿毒癥心肌病和缺血性心臟病，尿毒癥時(shí)心臟的病理結(jié)構(gòu)改變主要為左心室肥大、心肌間質(zhì)纖維化及微血管病變，并伴有心肌細(xì)胞的丟失。細(xì)胞自噬是一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)蛋白再循環(huán)機(jī)制，其能導(dǎo)致不同于凋亡的不依賴于caspase途經(jīng)的程序性細(xì)胞死亡，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、過(guò)氧化損害等均可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。多種CVD(如心肌病、心臟缺血再灌注損傷、心功能不全等)存在心肌細(xì)胞自噬現(xiàn)象。有研究表明心肌細(xì)胞對(duì)自噬引起的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變尤其敏感[2]，抑制心肌細(xì)胞的自噬可以改善擴(kuò)張性心肌病的心功能[3]。目前關(guān)于尿毒癥心肌病自噬的發(fā)生情況及其對(duì)心功能影響的研究較少。因此，本研究擬制備小鼠模型并觀察不同方法干擾尿毒癥心肌病心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生和變化情況，探討自噬在尿毒癥心肌病細(xì)胞損傷中的作用，為進(jìn)一步研究尿毒癥患者心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 2015年8—12月選擇SPF級(jí)C57BL/6-PAX6雄性小鼠50只，周齡為8周，體質(zhì)量19～21 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物研究所；Atg5及Cathepsin D抗體購(gòu)自DaKo公司；Rab7、LC3、Beclin-1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)抗體購(gòu)自Cell Signal公司；α-Tubulin抗體、渥曼青霉素、肌酐和尿素ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司；腺病毒攜帶的Beclin-1由日本岐阜大學(xué)竹村教授友情贈(zèng)送。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)小鼠分成對(duì)照組(6只)、假手術(shù)組(8只)、實(shí)驗(yàn)組〔5/6NC組(6只)、5/6NC+生理鹽水組(10只)、5/6NC+渥曼青霉素組(10只)以及5/6NC+Beclin-1組(10只)〕。對(duì)照組研究過(guò)程中不做任何干預(yù)。假手術(shù)組僅與實(shí)驗(yàn)組同期進(jìn)行兩次手術(shù)，但不切除腎臟。實(shí)驗(yàn)組制備5/6腎切除尿毒癥小鼠模型。造模6周時(shí)，5/6NC組不進(jìn)行干預(yù)，5/6NC+生理鹽水組、5/6NC+渥曼青霉素組、5/6NC+Beclin-1組根據(jù)文獻(xiàn)[4]分別給以0.9%氯化鈉溶液1 ml 腹腔內(nèi)注射，隔日1次；渥曼青霉素1 mg·kg-1·次-1，腹腔內(nèi)注射，1次/d；腺病毒攜帶的Beclin-1 1×109pfu腿部肌肉注射，1次/只。造模12周時(shí)用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組小鼠心功能后處死小鼠。分別收集血液及心臟標(biāo)本。

1.3 5/6腎切除尿毒癥模型的制備 采用10%戊巴比妥鈉溶液(150 μl)腹腔注射麻醉小鼠。小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，小鼠腹部用0.5%洗必泰溶液消毒手術(shù)區(qū)域皮膚。采用腹部左側(cè)切口開(kāi)腹后暴露左腎，將腎上腺和腎周脂肪與腎臟分離，游離出左腎。采用聚乙醇酸縫合線結(jié)扎左腎上下兩極(占腎臟體積各約1/3)后，眼科剪剪去上下極的同時(shí)明膠海綿壓迫止血2 min。切除完畢后將殘腎復(fù)位至腎窩，將臟器及腹膜覆蓋于上，并逐層縫合腹膜和皮膚。1 周后，同樣方法暴露右側(cè)腎臟，分別結(jié)扎右腎動(dòng)靜脈及輸尿管后，切除右腎。

1.4 小鼠心腎功能測(cè)定 造模12周時(shí)用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組小鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左心室短軸縮短率(LVFS)，評(píng)估各組小鼠的心功能狀況。小鼠檢測(cè)完心功能后，處死小鼠前從腹主靜脈采血，分離血清，采用 ELISA法檢測(cè)血肌酐和尿素氮。

1.5 小鼠心肌組織病理學(xué)處理 對(duì)照組、5/6NC組小鼠檢測(cè)完心功能及采集完血液樣本后處死，收集心臟標(biāo)本，用甲醛溶液固定，乙醇溶液脫水，二甲苯溶液透明及石蠟包埋，切成4 μm厚切片，烤箱過(guò)夜。進(jìn)行Atg5、Cathepsin D、Rab7抗體免疫組化染色，采用卵白素-生物素-酶復(fù)合物(ABC)法進(jìn)行染色，步驟嚴(yán)格按照抗體說(shuō)明書操作，被染成棕褐色的為陽(yáng)性細(xì)胞，染色后光鏡下觀察10個(gè)高倍鏡(×400)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.6 自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1及AKT的測(cè)定 LC3、Beclin-1及AKT的檢測(cè)采用Western blotting法。心肌組織蛋白提取：用頸椎脫臼法處死對(duì)照組、5/6NC+生理鹽水組、5/6NC+渥曼青霉素組、5/6NC+Beclin-1組小鼠，70%乙醇溶液浸泡5 min，開(kāi)胸摘取心臟，去除心臟周圍結(jié)締組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，在試管中加入1 ml蛋白提取液，然后將心肌組織超聲勻漿化，離心取上清液備測(cè)。BCA法進(jìn)行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，ECL plus顯色，用Image J軟件進(jìn)行圖像采集和定量分析。

2 結(jié)果

2.1 心腎功能變化 造模12周時(shí)，與對(duì)照組及假手術(shù)組比較，5/6NC組、5/6NC+生理鹽水組LVEDD增厚，LVFS降低，肌酐、尿素氮升高；與5/6NC+生理鹽水組比較，5/6NC+渥曼青霉素組LVEDD減少，LVFS升高，肌酐、尿素氮降低；與對(duì)照組、5/6NC+生理鹽水組比較，5/6NC+Beclin-1組LVEDD增加，LVFS降低，肌酐及尿素氮升高；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2 心肌組織病理變化 免疫組化染色顯示5/6NC組心肌細(xì)胞Atg5、Cathepsin-D、Rab7表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)(見(jiàn)圖1，本文圖1彩圖見(jiàn)本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。對(duì)照組與5/6NC組Atg5、Cathepsin-D、Rab7陽(yáng)性細(xì)胞率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表2)。2.3 心肌組織自噬相關(guān)蛋白及AKT的表達(dá) 5/6NC+生理鹽水組、5/6NC+Beclin-1組心肌組織細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1及AKT表達(dá)均較對(duì)照組升高；5/6NC+渥曼青霉素組LC3、Beclin-1、AKT表達(dá)雖較對(duì)照組升高，但低于5/6NC+生理鹽水組、5/6NC+Beclin-1組；5/6NC+Beclin-1組LC3、Beclin-1、AKT表達(dá)較5/6NC+生理鹽水組和5/6NC+渥曼青霉素組升高；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2、表3)。

Table1Comparisonofcardiacandrenalfunctionindexamongeachgroups12weeksaftermodelestablished

組別只數(shù)LVEDD(mm)LVFS(%)肌酐(mg/dl)尿素氮(mg/dl)對(duì)照組637±04351±21030±006281±35假手術(shù)組838±02337±19032±005282±375/6NC組656±07ab242±18ab071±006ab883±69ab5/6NC+生理鹽水組1058±06ab230±26ab066±005ab875±78ab5/6NC+渥曼青霉素組1043±03c326±34c047±008c338±43c5/6NC+Beclin-1組1069±09ac154±47ac097±009ac1075±104acF值1138141728622005P值<0001<0001<0001<001

注：LVEDD=左心室舒張末期內(nèi)徑，LVFS=左心室短軸縮短率；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與假手術(shù)組比較，bP<0.05；與5/6NC+生理鹽水組比較，cP<0.05

Table 2 Comparison of Atg5，Cathepsin-D，and Rab 7 positive cells rate between control group and 5/6NC group

組別只數(shù)Atg5Cathepsin-DRab7對(duì)照組639±0821±0734±045/6NC組6231±12198±13243±16t值2253451657P值<001<001<001

圖1 對(duì)照組與5/6NC組免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(ABC法，×400)

表3 對(duì)照組與5/6NC+生理鹽水組、5/6NC+渥曼青霉素組、5/6NC+Beclin-1組心肌組織LC3、Beclin-1及AKT表達(dá)比較

Table 3 Comparison of expression of LC3,Beclin-1，and AKT in myocardium among control group,5/6NC+saline group,5/6NC+wortmannin group and 5/6NC+Beclin-1 group

組別只數(shù)LC3Beclin-1AKT對(duì)照組615±0605±0102±0145/6NC+生理鹽水組1041±03a20±03a32±02a5/6NC+渥曼青霉素組1023±05ab14±04ab16±05ab5/6NC+Beclin-1組1061±06abc30±04abc30±04acF值317440358P值004001003

注：AKT=絲氨權(quán)/蘇氨酸蛋白激酶；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與5/6NC+生理鹽水組比較，bP<0.05；與5/6NC+渥曼青霉素組比較，cP<0.05

圖2 對(duì)照組、5/6NC+生理鹽水組、5/6NC+渥曼青霉素組、5/6NC+Beclin-1組心肌組織LC3、Beclin-1、AKT表達(dá)

Figure 2 Expression of LC3,Beclin-1，and AKT in myocardium among control group,5/6NC+saline group,5/6NC+wortmannin group,and 5/6NC+Beclin-1 group

3 討論

3.1 5/6腎切除尿毒癥小鼠模型的建立 本研究采用5/6腎切除的方法建立尿毒癥模型，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠LVEDD增加，LVFS降低，肌酐及尿素氮水平顯著升高，出現(xiàn)腎功能不全，符合后續(xù)研究要求。建立尿毒癥動(dòng)物模型，有高嘌呤食物誘導(dǎo)、電凝燒灼、經(jīng)液氮冷凍等多種方法，5/6 腎切除模型是根據(jù)殘存腎單位出現(xiàn)高灌注、高濾過(guò)和高壓力，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化和殘余腎單位進(jìn)一步破壞更接近于臨床高發(fā)的腎功能不全。

3.2 5/6腎切除尿毒癥小鼠與心肌自噬的關(guān)系 有研究發(fā)現(xiàn)，多種心臟疾病中存在心肌細(xì)胞自噬現(xiàn)象，如心肌病、心肌缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病等[5-6]。然而心肌細(xì)胞的自噬在不同心臟疾病中對(duì)心功能的影響是利是弊，目前尚有較大爭(zhēng)議。在心肌缺血再灌注損傷的研究中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在心肌缺血的早期細(xì)胞自噬對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，而在再灌注期或長(zhǎng)期慢性缺血時(shí)則導(dǎo)致細(xì)胞的自噬性死亡，加劇病情的進(jìn)展[7]。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)在壓力負(fù)荷所致的慢性心功能不全小鼠中心肌細(xì)胞自噬明顯增加并伴有心肌細(xì)胞的重塑，加重心功能不全[8]。本研究在建立尿毒癥小鼠模型12周后，超聲心動(dòng)圖顯示LVEDD增加，LVFS降低，提示心肌功能受損。Atg5是自噬相關(guān)基因的一種表達(dá)產(chǎn)物，參與自噬前體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成；Cathepsin-D是一種天冬氨酸蛋白酶,屬于溶酶體酸性蛋白酶家族,其在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分解代謝中起關(guān)鍵作用；Rab7是一種GTP結(jié)合蛋白,其在吞噬泡的形成過(guò)程中起重要作用，三者均與自噬活性呈正相關(guān)[9-10]。本研究免疫組化結(jié)果顯示尿毒癥小鼠Atg5、Cathepsin-D、Rab7表達(dá)較正常對(duì)照小鼠明顯增多，可見(jiàn)尿毒癥小鼠心肌自噬活性也增強(qiáng)。由此推測(cè)，自噬與尿毒癥小鼠心肌功能受損有關(guān)。

3.3 調(diào)節(jié)自噬活性與尿毒癥小鼠心肌損傷的關(guān)系 Beclin-1是哺乳動(dòng)物中重要的自噬促進(jìn)基因，作用于自噬的成核時(shí)期，是啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵蛋白。LC3是由哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母自噬相關(guān)基因8(ATG8)編碼，屬于一個(gè)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膜運(yùn)輸和/或結(jié)合的蛋白家族。LC3定位于自噬體的內(nèi)外膜上，有LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ兩種形式，成型后的 LC3-Ⅱ會(huì)穩(wěn)定地結(jié)合于胞內(nèi)自噬體的膜上，因而，LC3 的表達(dá)強(qiáng)度與自噬機(jī)制的活性密切相關(guān)[11]。Beclin-1與Ⅲ型磷酸酰肌醇3-激酶(PI3K)形成復(fù)合體，使磷脂酰肌醇發(fā)生磷酸化，生成3-磷酸磷脂酰肌醇，參與了自噬前體復(fù)合物的形成，在自噬小體膜的來(lái)源中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)與自噬活性密切相關(guān)[12]。本研究用Beclin-l刺激尿毒癥小鼠，發(fā)現(xiàn)5/6NC+Beclin-1組LC3、Beclin-1的表達(dá)顯著增加，顯然Beclin-l促進(jìn)了自噬的活性。通過(guò)比較可以看出5/6NC+Beclin-1組小鼠無(wú)論是腎功能還是心功能均較5/6NC+生理鹽水組明顯加重。故認(rèn)為過(guò)度的自噬可以加重尿毒癥小鼠心肌的損傷。這與文獻(xiàn)報(bào)道的抑制自噬可以減輕糖尿病小鼠的心肌損傷相符合[13]。渥曼青霉素是一種常用的PI3K抑制劑，可以通透細(xì)胞，和PI3K的催化亞基相結(jié)合，特異性地抑制PI3K，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路。本研究采用渥曼青霉素刺激尿毒癥小鼠，觀察其對(duì)尿毒癥小鼠心肌細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果提示渥曼青霉素抑制了LC3、Beclin-1的表達(dá)和AKT的合成，自噬活性被抑制。與5/6NC+生理鹽水組比較，5/6NC+渥曼青霉素組小鼠腎功能和心功能明顯好轉(zhuǎn)，進(jìn)一步證明了自噬對(duì)尿毒癥小鼠心肌細(xì)胞以及腎臟功能的影響。本研究顯示，渥曼青霉素組的肌酐及尿素氮水平稍高于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本量以及小鼠自身的代償功能有關(guān)。RINKEVICH等[14]研究發(fā)現(xiàn)，駐留在小鼠腎臟的干細(xì)胞能通過(guò)Wnt信號(hào)通路進(jìn)行自我修復(fù)。本組前期研究中也發(fā)現(xiàn)5/6腎切除小鼠5周后肌酐和尿素氮開(kāi)始上升，12周左右趨于穩(wěn)定，之后又出現(xiàn)小幅的下降。

3.4 尿毒癥小鼠心肌自噬調(diào)節(jié)機(jī)制 AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，處于PI3K/AKT信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)，PI3K的激活將致AKT磷酸化，活化后的AKT啟動(dòng)通路下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。因此AKT的表達(dá)情況可以反映PI3K/Akt信號(hào)通路的活化狀態(tài)[15]。自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，PI3K/Akt信號(hào)通路是自噬調(diào)節(jié)的一條重要途徑。本研究利用PI3K抑制劑渥曼青霉素處理尿毒癥小鼠，發(fā)現(xiàn)AKT表達(dá)明顯下降，自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin蛋白的表達(dá)也顯著減少，由此可見(jiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路參與了尿毒癥心肌細(xì)胞自噬活性的調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究首次從心肌細(xì)胞自噬的角度研究尿毒癥心臟病的病理變化。通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)方法研究尿毒癥心臟病時(shí)其心肌自噬的改變，證明尿毒癥小鼠心肌細(xì)胞存在細(xì)胞自噬現(xiàn)象，且心肌細(xì)胞自噬與尿毒癥小鼠心功能改變密切相關(guān)，Beclin-1基因及PI3K/AKT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)尿毒癥心肌細(xì)胞自噬中起調(diào)節(jié)作用，這為尿毒癥心肌病的預(yù)防和治療提供了新思路。然而自噬的發(fā)生是否與尿毒癥毒素或炎性因子的刺激有關(guān)，尿毒癥毒素的清除是否可以改變自噬活性改善心肌功能，還有待進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：龔建光進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；金娟、趙黎、林波、梁世凱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；何強(qiáng)、李一文進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

本文創(chuàng)新點(diǎn)/不足：

(1)本研究首次從心肌細(xì)胞自噬的角度研究尿毒癥心臟病的病理變化，并且通過(guò)自噬的調(diào)節(jié)來(lái)觀察尿毒癥小鼠心腎功能的變化，證實(shí)了心肌細(xì)胞自噬與尿毒癥小鼠心功能改變密切相關(guān)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Beclin-1基因及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號(hào)通路在調(diào)節(jié)尿毒癥心肌細(xì)胞自噬中起調(diào)節(jié)作用，本研究為開(kāi)發(fā)新的通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞自噬的方法治療尿毒癥心肌病提供理論依據(jù)。

(2)本研究?jī)H進(jìn)行了小鼠模型體內(nèi)研究，缺少體外實(shí)驗(yàn)的支持；另外本研究?jī)H觀察了自噬標(biāo)記物蛋白表達(dá)情況，如果增加mRNA水平的檢測(cè)將更有說(shuō)服力；本研究?jī)H證實(shí)了Beclin-1基因及PI3K/AKT信號(hào)通路在尿毒癥心肌細(xì)胞自噬中起調(diào)節(jié)作用，但具體如何調(diào)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)存在一些瑕疵，且各組設(shè)計(jì)的目的有所差別，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中并沒(méi)有將所有組進(jìn)行同步實(shí)驗(yàn)，在今后實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)會(huì)吸取經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)加以改進(jìn)。

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(本文編輯：趙躍翠)

Effect of Autophagy on Cardiac Myocytes Injury in Uremic Cardiomyopathy Mice

GONG Jian-guang,JIN Juan,ZHAO Li,LIN Bo,LIANG Shi-kai,HE Qiang,LI Yi-wen.

Department of Nephrology,Zhejiang Provincial People′s Hospital,Hangzhou 310014,China

LI Yi-wen,Department of Nephrology,Zhejiang Provincial People′s Hospital,Hangzhou 310014,China；E-mail：yiwen1962@163.com

Objective To explore the effect and mechanism of autophagy on cardiac myocytes injury in uremic cardiomyopathy mice.Methods From August to December 2015，fifty male C57BL/6-PAX6 mice in a SPF grade were selected in our study.The mice were randomly divided into control group(6),sham operation group(8),test groups〔5/6 nephrectomy(NC) group (6),5/6NC+saline group(10),5/6NC+wortmannin group(10) and 5/6NC+Beclin-1 group(10)〕.The control group did not receive any intervention in the study.The sham operation group only received surgery and anesthesia procedures simultaneous with the test groups,but the kidneys were not removed.5/6 mice nephrectomy model were established in the test groups.Six weeks after model establishment,5/6 NC group did not receive intervention.5/6NC+saline group was given 0.9% sodium chloride solution 1 ml intraperitoneal injection,1 time every other day.5/6NC+wortmannin group was given wortmannin 1 mg/kg intraperitoneal injection,1 time/day.5/6NC+Beclin-1 group was given adenovirus carrying Beclin-1 1 ×109pfu intramuscular injection,1 time/once.12 weeks after model establishment,mice heart function was measured by ultrasonic cardiograph,and renal function was measured by ELISA.In addition,we analyzed the expression of autophagy and its associated protein in mice myocardium using Western blotting and immunohistochemical staining after sacrificed.Results 12 weeks after model establishment,compared with control group and sham operation group,LVEDD significantly increased,LVFS significantly increased and serum creatinine and urea nitrogen level significantly increased in the 5/6NC group and 5/6NC+saline group(P<0.05).Compared with 5/6 NC+saline group,LVEDD significantly decreased,LVFS significantly increased,serum creatinine and urea nitrogen level significantly decreased in the 5/6NC+wartmannin group(P<0.05).Compared with control group and 5/6 NC+saline group,LVEDD significantly increased,LVFS significantly decreased,serum creatinine and urea nitrogen level significantly increased in the 5/6 NC+Beclin-1 group (P<0.05).Immunohistochemical staining showed that the expression of Atg5,Cathepsin-D and Rab 7 in the myocardial cells of 5/6NC group were significantly higher than that in control group(P< 0.05).There were significant differences in the rate of Atg5,Cathepsin-D and Rab7 positive cells between the control group and 5/6NC group(P<0.05).The expressions of autophagy-related protein LC3,Beclin-1 and AKT in the 5/6 NC+saline group and 5/6NC+Beclin-1 group were significantly higher than those in the control group (P<0.05).The expressions of LC3,Beclin-1 and AKT in 5/6 NC+wortmannin penicillin group were higher than those in control group,but lower than those in 5/6NC+saline group,5/6NC+Beclin-1 group (P<0.05).The expression of LC3,Beclin-1 and AKT in the 5/6 NC+Beclin-1 group were higher than those in 5/6 NC+saline group and 5/6 NC+wartmannin group(P<0.05).Conclusion Autophagy was closely related to cardiomyocytes injury in uremic mice.Enhancement or inhibition of autophagy could aggravate or relieve cardiac and renal function in uremic mice.Beclin-1 gene and PI3K/AKT signal proteins played an important role in regulation cardiomyocytes autophagy.

Cardiomyopathies；Uremia；Autophagy；Autophagy associated protein；PI3K/AKT signal protein

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y2080371)；浙江省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(2016ZA023)

310014浙江省杭州市，浙江省人民醫(yī)院腎臟病科

李一文，310014浙江省杭州市，浙江省人民醫(yī)院腎臟病科；E-mail：yiwen1962@163.com

R 692.5

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.36.017

2016-08-20；

2016-11-25)