中華鉤線蟲的DNA條形碼研究及分類意義探討

孫 靜, 黃 勇

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中華鉤線蟲的DNA條形碼研究及分類意義探討

孫 靜, 黃 勇

(聊城大學生命科學學院, 山東聊城252000)

海洋線蟲是海洋底棲生物中數量上最豐富的類群, 在海洋生態系統中起著重要的作用。對海洋線蟲進行種類鑒定是線蟲研究中最重要的工作之一。目前, 海洋線蟲的鑒定主要采用形態學的分析方法, 但是這種方法往往費時費力, 對于如此豐富的物種, 急需新的鑒定方法。作者以黃海潮間帶自由生活線蟲優勢種——中華鉤線蟲 ()為例, 在形態學分類的基礎上, 將DNA條形碼技術引入線蟲的鑒定中, 探討了線粒體細胞色素C氧化酶第一亞基(mtCOI)基因序列、28S rDNA序列的D2D3區以及18S rDNA序列的部分序列作為DNA條形碼在中華鉤線蟲中的適用性。結果表明, 18S rDNA序列可作為該種線蟲的DNA條形碼, 為海洋線蟲的DNA條形碼研究提供了很好的借鑒。目前, 利用 DNA 條形碼技術對海洋線蟲進行鑒定的報道在國內還屬空白, 本研究將是海洋線蟲分類學研究的很好補充。同時, 對于了解該海域海洋線蟲多樣性及群落分布格局, 開展海洋環境監測, 進而對海洋的底質環境狀況進行健康評價具有十分重要的科學意義。

中華鉤線蟲(); 形態鑒定; DNA條形碼

海洋線蟲是小型底棲生物的永久性成員。在大多數生境中, 海洋線蟲是數量上最豐富的類群, 占后生動物數量的70%~90%, 在某些生境中可達到90%以上[1]。海洋線蟲還是海洋環境質量的重要指示者, 可以依據其密度、種類組成、群落結構變化對海洋底棲環境的健康狀況進行診斷。國內外已經有越來越多的學者將海洋線蟲和其他小型底棲生物作為海洋生態監測評估體系的一個重要指標, 應用于海洋環境監測中[2-3]。

對海洋線蟲進行種類鑒定是線蟲研究中最重要的工作之一。目前, 海洋線蟲的鑒定主要是采用形態學的分析方法[4-5]。這種方法以線蟲的形態特征和超微結構為基礎, 運用顯微鏡對線蟲進行鑒定, 是海洋線蟲分類鑒定的基礎。但是全球海洋線蟲的種類極其豐富, 約有十萬種之多, 對于如此豐富的物種, 在進行海洋線蟲生物多樣性的大規模調查研究中, 短時間內進行形態學的鑒定非常困難; 并且海洋線蟲的外部形態因發育階段的不同常發生很大的變化, 給主要依據形態特征來鑒定的經典分類工作帶來很大困難, 迫切需要新的研究手段。

DNA條形碼技術是實現快速鑒定的很好選擇。DNA條形碼通過一個標準化、較短的基因片段序列變異來鑒定物種, 是近年來生命科學和生物技術領域進展最迅速的前沿學科之一。該技術是傳統物種鑒定的強有力補充, 是分類學中輔助物種鑒定的新技術, 它代表了生物分類學研究的一個新方向, 并為海洋生物的分類和鑒定提供了有力工具[6-8]等。

本研究探討了線粒體細胞色素C氧化酶第一亞基(mtCOI)基因序列, 28S rDNA序列的D2D3區以及18S rDNA序列的部分序列作為DNA條形碼, 在中華鉤線蟲中的適用性, 以期為其他海洋線蟲的DNA條形碼研究提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和處理

沉積物樣品采自山東省煙臺市漁人碼頭(37°30′N, 121°26′E), 在沿岸及潮間帶進行采樣。用小型生物取樣管采集定量樣品, 用等量5%()的甲醛溶液固定, 用于線蟲的形態學鑒定和分子生物學分析。

1.2 線蟲分選、制片和形態學鑒定

1.2.1 分選

實驗室用0.1%虎紅染色24 h, 然后用過濾后的自來水沖洗, 使樣品通過500 μm和31 μm的兩層網篩, 對截留在31 μm網篩上的沉積物樣品, 用比重為1.15的Ludox-TM溶液轉移到離心管中, 攪拌均勻, 以1 800 r/min的轉速離心10 min。離心3次后, 將所得的上清液再通過31 μm的網篩, 過濾掉Ludox, 然后用蒸餾水把樣品轉移到培養皿中。向盛有線蟲的胚胎培養皿中加入一定量的甘油酒精水混合液(5%︰5%︰90%), 放入干燥箱。兩周后, 酒精和水揮發, 甘油滲入蟲體, 使線蟲身體透明, 便于觀察鑒定。

1.2.2 制片

在備好的干凈載玻片上, 滴甘油一滴, 挑選直徑大小一致的線蟲, 轉移至甘油中。選取直徑與蟲體直徑大致相同的玻璃珠3粒, 均勻放于甘油滴的邊緣, 然后加蓋蓋玻片, 周邊用加拿大樹膠封閉, 貼標簽后置于干燥箱中, 待樹膠干涸后即可觀察。

1.2.3 形態學鑒定

在微分干涉顯微鏡下進行觀察和測量, 依據線蟲形態結構特征進行鑒定[5]。

1.3 DNA條形碼分析

1.3.1 DNA提取

形態學鑒定完畢, 用滅菌的解剖刀移去蓋玻片, 將單條線蟲分別移至0.5 mL PCR管中, PBS緩沖液洗滌兩次, 提取線蟲DNA[9]。

1.3.2 PCR擴增及測序

分別選取針對mtCOI基因、28S rDNA的D2D3區以及18S rDNA的引物進行擴增[9-11], 引物序列如表一所示。將PCR產物進行克隆測序。

1.3.3 構建系統樹

從GenBank數據庫中下載海洋線蟲18S rDNA序列, 用Clustal X軟件比對序列, 之后用Mega 5.05構建NJ樹(Bootstrap設置為1000)。

表1 本實驗所用引物

2 結果

2.1 形態學鑒定

中華鉤線蟲(圖1)是中國海洋大學張志南教授于1983年發表的中國自由生活海洋線蟲研究的第一個新種。雄體長2 010~2 770 μm, 最大體寬38~42 μm。體表光滑無裝飾, 具縱向排列的短的體剛毛。頭部圓盾, 內唇感覺器乳突狀, 外唇感覺器剛毛狀, 與4條頭剛毛排列成一圈, 為6+10模式, 長約6 μm?？谇惠^大, 深24~26 μm, 內具3個角質化的齒, 其中左亞腹齒較大, 右亞腹齒和背齒較小?；衅鞔? 7~8 μm寬, 位于背齒齒尖處。排泄孔位于頭端后約120 μm處的腹面。神經環位于整個咽的中部; 咽管圓柱狀, 末端稍膨大, 與腸相連,長約占體長的16%。尾錐柱狀, 末端稍膨大成棒狀, 長90~94 μm, 約為肛部體寬的3.4~4倍。尾腺細胞位于肛前身體的后端。

兩條交接刺等長, 結構簡單, 稍彎曲, 近端頭狀,遠端尖, 中后部稍膨大, 長約為肛部體寬的1.2倍。無引帶。具一顯著的肛前肉質突起; 尾的中后部腹側有一肛后乳突, 上有2對長約3 μm的剛毛。除尾部亞背側剛毛外, 還有約11對長5~9 μm的環肛剛毛。

雌體較雄體大, 長3 380 μm, 最大體寬46 μm, 尾長134 μm, 為肛部體寬的4.8倍。具一前置, 反折狀的卵巢, 雌孔開口于身體的中后部的腹面, 距頭端距離約為體長的67%處。

1-1. 雄體前端, 示口腔、大的左亞腹齒和小的背齒; 1-2. 雌體頭端, 示頭剛毛、口腔、小的右亞腹齒和背齒; 1-3. 雄體尾端, 示交接刺、肛前乳突; 1-4. 雄體尾端, 示環肛剛毛和尾部乳突

1-1. Lateral view of male head end showing buccal cavity, large left subventral tooth, and small dorsal tooth; 1-2. Lateral view of female head end showing cephalic setae, buccal cavity, small right subventral tooth, and dorsal tooth; 1-3. Lateral view of male tail end showing spicules and precloacal papillae; 1-4. Lateral view of male tail end showingcircumanal setae and tail papillae

該線蟲廣泛分布于青島、煙臺、威海、日照等海濱潮間帶有機質豐富的泥沙質沉積物中, 為個體較大的優勢種。

2.2 PCR產物的瓊脂糖電泳檢測

中華鉤線蟲的COI基因及28S rDNA序列D2D3區的PCR未得到目的片段(COI基因擴增產物呈彌散狀, 而28S rDNA擴增產物有非特異性擴增), 僅18S rDNA序列PCR取得了比較好的結果, 擴增片段的大小為345 bp。從圖2可見, 線蟲DNA經PCR擴增后得到了一條特異性條帶(泳道最前端為引物二聚體), 說明該對引物具有較好的特異性。

2.3 序列比對及系統樹構建

將測得的序列與GenBank數據庫中的sp.(序列號 AY854196)進行比對, 發現序列相似度為96.2%, 有13個堿基的差異(332/345)(圖3)。從系統樹可以看出(圖4), 中華鉤線蟲與sp.聚為一支, 通過分析可以確定中華鉤線蟲的種屬關系, 達到鑒定的目的。由此可見, 該18S rDNA片段可以作為DNA條形碼用于鑒定該種線蟲。

M. DL2000; 1. 陰性對照; 2.3.

M. DL2000; 1. Negative control; 2.3.

3 討論

本研究的主要目的是以中華鉤線蟲為例, 探討DNA條形碼技術在海洋線蟲鑒定中的應用, 以期為海洋線蟲的DNA條形碼研究提供方法借鑒。

一般來講, 進行分子生物學方面的研究, 要將海洋線蟲進行乙醇固定。雖然這種固定方法便于進行DNA提取、PCR擴增等分析, 但也存在一定的弊端, 線蟲的某些表面特征會變得不容易識別, 進而影響形態學鑒定的準確性。所以本研究采用甲醛固定線蟲, 便于進行形態學分析, 同時對線蟲的DNA提取方法進行了改進。甲醛固定線蟲的DNA提取關鍵在于裂解時間的控制, 在按照試劑盒DNeasy Tissue Kit (Qiagen Inc, Crawley, UK)操作的基礎上, 將裂解時間延長至96 h[9], PCR模板的量增至5~15 μL,可以成功擴增出目的片段。該提取方法對甲醛固定及存檔的小型底棲生物標本, 進行分子鑒定和種群遺傳分析提供了很好的解決方法。

在本研究中, 中華鉤線蟲的COI基因及28S rDNA序列D2D3區的PCR, 經過反應體系及退火溫度的優化, 并未擴增出目的片段。以往研究曾指出, 這兩個基因作為海洋線蟲的DNA條形碼并不具有較高的適用性。COI基因的M1-M6區常作為DNA條形碼的標志性基因用于物種鑒定, 但是Derycke[10]認為I3-M11更適合用作海洋線蟲的DNA條形碼, 兩個片段的擴增效率比分別為87.8%和65.8%。但是本研究中采用了Derycke[10]設計的JB3(F)、JE5(R)和JB2(F)、JB5GED(R)兩對擴增效率最高的引物, 擴增條帶均呈彌散狀且無法進行克隆測序。據研究, 28S rDNA序列D2D3區的擴增效率也僅為62%[12]和67%[13]左右, 并且該對引物不適用于中華鉤線蟲(有非特異性擴增)。同時, 經福爾馬林固定的樣品, 會對線蟲的DNA造成一定的損壞, 使DNA片段化并直接影響DNA的提取效率, 這也是本研究未成功獲取中華鉤線蟲的COI基因及28S rDNA序列D2D3區的主要原因。最終結果表明, 18S rDNA可以作為有效的條形碼對中華鉤線蟲進行鑒定。該基因包含保守區和高變區, 便于進行引物設計, 并且屬于多拷貝基因, 比起單拷貝的基因具有更高的擴增效率[14]。

因此, 海洋線蟲條形碼的研究首先要找到一個合適的基因區域或者基因組合; 其次, 要建立一個地理區域范圍廣泛的序列庫, 以便進行海洋線蟲多樣性和進化關系的分析。高通量測序技術的發展, 推動了越來越多的公共序列數據庫(GenBank, EMBL, DDBJ, BOLD等)的建立, 這其中收錄了不少生物的條形碼信息, 為海洋線蟲的條形碼研究提供了序列基礎。但是基因區域的選擇在海洋線蟲的DNA條形碼研究中一直存在爭議?；谝酝难芯堪l現, COI基因[10, 15]、28S序列的D2D3區[13]以及18S區序列[16-17]均被認可作為海洋線蟲DNA條形碼使用, 用于海洋線蟲鑒定; 也有的學者建議多個基因片段組合使用(核基因和線粒體基因)將會取得更好的結果[15]。

目前國內研究主要是種類調查、種群結構以及監測潮間帶有機質污染等方面, 并且大多都是基于傳統的形態學研究, 這就需要大批海洋線蟲專家, 但效率低下, 且數據整合也比較困難。因此, 分子生物學的鑒定方法可以對海洋線蟲進行高效鑒定和分類[11, 18-19], 進而加速中國海區自由生活線蟲分類、區系研究、多樣性調查及新種的發掘, 為中國海洋生物資源保護提供科學依據。盡管海洋線蟲的DNA條形碼研究在中國還處于起步階段, 但隨著數據庫的完善和分析技術的發展, 基于DNA條形碼的快速、準確、簡便的海洋生物多樣性監測和現場實時定性、定量分析將成為可能[20]。新興的DNA條形碼技術將為中國海洋生態系統監測、海洋生物多樣性保護以及海洋生態學研究的發展提供強有力的支撐[21]; 這將是海洋線蟲分類學研究的很好補充, 在我國海洋線蟲研究中具有廣闊的應用前景。

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(本文編輯: 譚雪靜)

DNA barcoding analysis and taxonomic significance of the marine nematode

SUN Jing, HUANGYong

(School of Life Sciences, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

Marine nematodes are the most dominant and diverse meiofaunal group in marine benthic habitats. They are important to the functioning of estuarine and marine ecosystems. Identification of marine nematodes is one of the most significant aspects in their study. Nematode diagnostics has traditionally relied on detailed morphological examination that requires specialist taxonomic expertise. Given their abundance, morphological taxonomy is time consuming and laborious. The primary purpose of this study was to identifyZhang & Platt, 1983, using standard taxonomic approaches and DNA barcoding. Here, we describe the identification ofZhang & Platt, 1983, using the mitochondrial cytochrome oxidase c subunit (COI) gene, 28S sequences (D2D3 domain), and a short stretch of 18S rRNA sequence. Our results indicated that 18S rRNA sequence may be better suited for DNA barcoding of, providing a reference for barcoding marine nematodes. DNA barcodes provide powerful tools for rapid species identification and can be quickly applied in ecological studies on marine nematodes. DNA barcoding analysis of marine nematodes has not yet been reported in China. This study would be a good supplement to identification of marine nematodes. This would be of great significance to the assessment of nematode diversity and regional community distribution, monitoring of marine environment, and status evaluation of marine sediments.

Marine nematode; morphological identification; DNA barcoding

Feb. 26, 2015

Q7

A

1000-3096(2016)09-0039-06

10.11759//hykx20150226001

2015-02-26;

2015-04-23

山東省自然科學基金資助項目(ZR2014DM008); 聊城大學博士基金資助項目(3180500)

孫靜(1981-), 山東聊城人, 講師, 主要從事海洋生物學研究, E-mail: mythcherry@163.com.; 黃勇, 通信作者, 教授, E-mail: huangy@lcu.edu.cn

[Foundation: The Science Foundation of Department of Science and Technology of Shandong Province, No. ZR2014DM008; The Doctoral Program Foundation of Liaocheng University, No. 3180500]