海灣扇貝維甲酸受體(RXR) cDNA克隆與表達(dá)分析

張 瑞, 闕華勇, 叢日浩, 李 莉, 張國(guó)范

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海灣扇貝維甲酸受體(RXR) cDNA克隆與表達(dá)分析

張 瑞1, 2, 闕華勇1, 叢日浩1, 李 莉1, 張國(guó)范1

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所, 山東青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

維黃酸受體(RXR)是核受體超家族的重要成員, 已有研究表明其在脊椎動(dòng)物中廣泛參與調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝等多種重要的生理過(guò)程。本研究采用 RACE 技術(shù)克隆獲得海灣扇貝() RXR (AiRXR) cDNA序列, 采用熒光定量RT-PCR 技術(shù)分析該基因在性腺發(fā)育不同時(shí)期的不同組織中的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果表明, AiRXR的cDNA序列開(kāi)放閱讀框?yàn)?338bp, 含有兩個(gè)亞型: AiRXRα和AiRXRβ, 兩個(gè)亞型之間在T-box中相差4個(gè)氨基酸。該蛋白序列與人 () 和櫛孔扇貝 () 等的RXR相似性很高。AiRXR進(jìn)化樹(shù)分析顯示, AiRXR與軟體動(dòng)物RXR聚為一支。AiRXR基因具有廣泛的組織表達(dá)特點(diǎn), 在檢測(cè)的組織中(外套膜、鰓、性腺、閉殼肌)均有表達(dá), 推測(cè)AiRXR以信號(hào)分子的形式參與多種組織細(xì)胞的生命過(guò)程; 在海灣扇貝性腺發(fā)育過(guò)程中AiRXR基因在性腺發(fā)育的各時(shí)期均有表達(dá)且增殖期表達(dá)量最高, 說(shuō)明AiRXR基因可能參與調(diào)節(jié)性腺發(fā)育和分化的過(guò)程。

海灣扇貝(); RXR基因; 組織表達(dá); 性腺發(fā)育

核受體超家族是一大類(lèi)組成型的轉(zhuǎn)錄因子, 能夠調(diào)控多種代謝途徑如胚胎發(fā)育、內(nèi)環(huán)境和生理的穩(wěn)態(tài)[1]。維甲酸X受體 (RXR) 作為核受體超家族中的一員, 含有5個(gè)典型的核受體結(jié)構(gòu)域: A/B、C、D、E和F。A/B結(jié)構(gòu)域中含有活性的配體非依賴性的轉(zhuǎn)錄激活域 (AF-1), 能夠增強(qiáng)E結(jié)構(gòu)域中AF-2的作用, 從而上調(diào)靶基因的表達(dá)。C結(jié)構(gòu)域中含有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域中含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu), 能夠介導(dǎo)核受體與位于靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特異順向重復(fù)序列(也稱反應(yīng)元件)結(jié)合。D結(jié)構(gòu)域是鉸鏈結(jié)構(gòu)域, 含有一個(gè)相對(duì)保守的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (LBD), 可以與配體結(jié)合, 改變蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)而誘導(dǎo)基因表達(dá), E區(qū)含一個(gè)配體依賴性的轉(zhuǎn)錄激活域 (AF-2), 它能傳遞配體結(jié)合信號(hào), 控制配體依賴的轉(zhuǎn)錄和激活; F結(jié)構(gòu)域序列保守性很低, 具有較高的可變性[2-3]。在脊椎動(dòng)物中, RXR分為三個(gè)亞型: α、β和γ, RXR作為轉(zhuǎn)錄因子與其他核受體成員如蛻皮激素受體(EcR)、視黃酸受體 (RAR)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 (PPAR) 形成二聚體結(jié)合靶基因參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、新陳代謝等多種重要的生理過(guò)程[4-6]。在無(wú)脊椎動(dòng)物如海綿動(dòng)物[7]、昆蟲(chóng)[8]、甲殼動(dòng)物[9]等類(lèi)群中也克隆獲得RXR的同源基因序列。

海灣扇貝 (自然分布于美國(guó)的東海岸和墨西哥灣沿岸, 于1982年首次成功引入我國(guó), 實(shí)現(xiàn)了苗種全人工培育, 帶動(dòng)海灣扇貝成為我國(guó)主要海水養(yǎng)殖貝類(lèi)之一[10]。性腺發(fā)育分為五個(gè)時(shí)期: 分化期、增殖期、成熟期、排放期和休止期[11-12]。親貝性腺發(fā)育的成熟度和同步性直接影響著苗種生產(chǎn)成敗, 但迄今對(duì)貝類(lèi)性腺發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制知之甚少。本研究采用 RACE 技術(shù)克隆獲得海灣扇貝RXR cDNA序列并分析其結(jié)構(gòu), 采用熒光定量RT-PCR 技術(shù)分析該基因在性腺發(fā)育不同時(shí)期的不同組織中的表達(dá)特點(diǎn), 旨在探究RXR基因在海灣扇貝發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用, 為進(jìn)一步開(kāi)展雙殼類(lèi)RXR的功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 海灣扇貝樣品的獲取

海灣扇貝()取自青島市古鎮(zhèn)口灣, 在性腺發(fā)育的5個(gè)時(shí)期: 分化期、生長(zhǎng)期、成熟期、排放期和休止期分別采集其鰓、性腺、外套膜、閉殼肌的組織樣品, 取樣后的組織置于–80℃冰箱中待用。

1.2 海灣扇貝RXR基因的克隆

采用Trizol 法提取海灣扇貝總RNA, 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) 檢測(cè)提取的RNA 濃度。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Japan) 合成RACE cDNA 第一條鏈, 以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用海灣扇貝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)獲得RXR基因序列片段, 根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)引物: AiRXR-F和AiRXR-R, 凝膠電泳檢測(cè)條帶的大小, PCR反應(yīng)體系為25 μL, 其中cDNA模板2 μL、EX-taq酶 (TaKaRa, Japan) 12.5 μL、滅菌水10 μL、引物各0.5 μL, PCR反應(yīng)條件: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共35個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min。對(duì)該基因片段進(jìn)行驗(yàn)證后, 設(shè)計(jì)RACE引物。采用巢式PCR擴(kuò)增得到海灣扇貝 RXR cDNA的全長(zhǎng), RXR基因的全長(zhǎng)所用引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系25 μL, 其中cDNA模板2 μL、LA-taq酶 (TaKaRa, Japan) 12.5 μL、滅菌水10 μL、引物各0.5 μL, PCR反應(yīng)條件: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共35個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min。擴(kuò)增并純化后連接到pEASY-T1 載體(北京全式金生物技術(shù)公司)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞 (北京全式金生物技術(shù)公司)中, 涂平板, 37℃培養(yǎng)過(guò)夜, 挑取抗氨芐青霉素的陽(yáng)性克隆, 經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后, 交由北京六合華大股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 RXR基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

運(yùn)用ORF finder (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/gorf/) 預(yù)測(cè)克隆基因的開(kāi)放閱讀框 (ORF), 在NCBI Genbank BLAST (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov/genbank/) 尋找與海灣扇貝RXR的同源序列, 通過(guò)CLUS-TALW (http: //www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/) 進(jìn)行多序列同源比對(duì), 并用BioEdit軟件分析。根據(jù)在線BLASTp(http: //blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè), 利用MEGA軟件 (http: //www.megasoftware.net)中的最大似然法對(duì)預(yù)測(cè)RXR的DBD和LBD的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.4 海灣扇貝各組織RXR基因的表達(dá)

利用ABI 7500 Fast 熒光定量PCR儀, 分析海灣扇貝RXR (RXR, AiRXR) 在海灣扇貝性腺發(fā)育5個(gè)時(shí)期不同組織中的定量表達(dá), 每個(gè)樣本做3 個(gè)平行檢測(cè)。已有的研究表明, RXR的異構(gòu)體在組織的表達(dá)沒(méi)有明顯的差異[13], 因此在海灣扇貝RXR cDNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物: AiRXR-DOU-F和AiRXR-DOU-R(表1)。熒光定量RT-PCR 反應(yīng)條件: 94℃ 30s, 1個(gè)循環(huán); 94℃ 5s, 60℃ 30s, 40個(gè)循環(huán)。通過(guò)ABI 7500 Fast SDS software V2.0 軟件輸出數(shù)據(jù), 采用2–DDCt法對(duì)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析, 18S rRNA 作為內(nèi)參基因。使用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(0.05)。

表1 引物序列

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 海灣扇貝RXR基因的cDNA 克隆

克隆擴(kuò)增得到AiRXR的cDNA含有兩個(gè)亞型: AiRXRα和AiRXRβ, 異構(gòu)體中長(zhǎng)度最短的AiRXRα編碼序列1338bp, 編碼446個(gè)氨基酸, 理論的等電點(diǎn)為6.89, 軟件預(yù)測(cè)蛋白為49.10 ku (http: //web. expasy.org/compute_pi/), AiRXRβ在AiRXRα的T-box 區(qū)域A 和V之間插入了4個(gè)氨基酸 (CLAA)。氨基酸序列比對(duì)顯示AiRXR含有典型的RXR家族結(jié)構(gòu)即含有兩個(gè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (LBD), DBD中含有P-BOX (EGCGK) 和D-BOX (CREER)。D區(qū)存在T-box (EAVQEERQR), E結(jié)構(gòu)域中AF-2可激活RXR的轉(zhuǎn)錄活性(圖1)。

2.2 同源序列分析和進(jìn)化樹(shù)分析

將克隆得到的AiRXR的DBD和LBD結(jié)構(gòu)域分別與人 ()、斑馬魚(yú) ()、小鼠()、爪蟾 () 和櫛孔扇貝 () 等13個(gè)物種的22個(gè) RXR氨基酸的DBD和LBD結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源比對(duì), 發(fā)現(xiàn)AiRXRα和AiRXRβ與人和爪蟾的同源性均為79%~84%, 與櫛孔扇貝RXR的同源性高達(dá)90% (圖2)。

(, 光滑雙臍螺, AAL86461)、(, 招潮蟹, AAC32789)、(, 大型蚤, ABF74729)、(, 斑馬魚(yú), NP_571228)、(, 斑馬魚(yú), NP_571313)、(, 斑馬魚(yú), NP_001002345)、(, 陸地蟹, AAZ20368)、(, 人, ABB96254)、(, 人, AAA60293)、(, 人, AAA80681)、(, 東亞飛蝗, AAQ55293)、(, 靜水椎實(shí)螺, AAW34268)、(, 小鼠, NP_035435)、(, 大西洋犬峨螺, ABS70715)、(, 大西洋犬峨螺, ABS70716)、(, 荔枝螺, AAU12572)、(, 爪蟾, P51128)、(, 爪蟾, NP_001080936)、(, 爪蟾, NP_001088948)、(, 櫛孔扇貝, AFL91696.1)、(, 櫛孔扇貝, AFL91697.1)、(, 櫛孔扇貝, AFL91698.1)、-(, 櫛孔扇貝, AFL91699.1)。P-box、D-box、T-box和AF-2用框架標(biāo)記

利用MEGA5.0軟件對(duì)AiRXR與其他13個(gè)物種的RXR的DBD和LBD部分結(jié)構(gòu)域構(gòu)建進(jìn)化樹(shù), 發(fā)現(xiàn)AiRXR與櫛孔扇貝RXR聚在一起, 并與其他軟體動(dòng)物聚為一大支, 與脊椎動(dòng)物RXR分離開(kāi), 說(shuō)明AiRXR屬于RXR家族成員, 并且序列相對(duì)保守(圖3)。

GenBank accession number:(AAL86461)、(AAC32789)、(ABF74729)、(NP_571228)、(NP_571313)、(NP_001002345)、(AAZ20368)、(ABB96254)、(AAA60293)、(AAA80681)、(AAQ55293)、(AAW34268)、(NP_035435)、(ABS70715)、(ABS70716)、(AAU12572)、(P51128)、(NP_001080936)、(NP_001088948)、(AFL91696.1) 、(AFL91697.1) 、(AFL91698.1)、(AFL91699.1)。海灣扇貝RXR用框架標(biāo)記

2.3 海灣扇貝RXR在性腺不同發(fā)育時(shí)期各組織中的表達(dá)

熒光定量PCR用于檢測(cè)AiRXR在性腺不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá), 結(jié)果表明, AiRXRα與AiRXRβ mRNA在性腺發(fā)育的五個(gè)時(shí)期: 分化期、增殖期、成熟期、排放期和休止期中均有表達(dá), 但在性腺增殖期表達(dá)量最高(<0.05)。在性腺發(fā)育時(shí)期, AiRXR在組織中的表達(dá)差異顯著(<0.05); 在發(fā)育時(shí)期的性腺組織中, AiRXR在增殖期的表達(dá)量最高, 并在成熟期、排放期和休止期中表達(dá)量迅速下降 (圖4)。

3 討論

本研究首次克隆獲得海灣扇貝RXR基因(AiRXR)的cDNA 序列, 發(fā)現(xiàn)其含有2個(gè)RXR亞型: AiRXRα和AiRXRβ, 蛋白預(yù)測(cè)表明兩個(gè)異構(gòu)體之間插入一個(gè)相差12個(gè)核苷酸的T-box (+4)。在腹足類(lèi)軟體動(dòng)物如[14]和[4]中也發(fā)現(xiàn)了相似的RXR的異構(gòu)體。對(duì)其進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè), 顯示其具有RXR核受體家族蛋白所具有的A-F區(qū)域的完整結(jié)構(gòu)。從N 端到C 端, 海灣扇貝RXR氨基酸序列的C 區(qū)存在高度保守的P-box和D-box兩個(gè)典型的結(jié)構(gòu), 其中P-box主要參與特異性結(jié)合DNA, D-box與同型二聚體的形成有關(guān)。D 區(qū)存在參與DNA 識(shí)別的T-box, 由于AiRXRα和AiRXRβ在T-box相差4個(gè)氨基酸序列, 因此AiRXRα和AiRXRβ在識(shí)別靶基因的位置存在差異。E/F結(jié)構(gòu)域中的AF-2能夠傳遞配體結(jié)合信號(hào), 控制配體依賴的轉(zhuǎn)錄和激活[15]。

在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)RXR與9-順式維甲酸 (9cRA) 有較高的親和力, 參與調(diào)控維甲酸信號(hào)途徑, 并且在腹足類(lèi)動(dòng)物、和中也發(fā)現(xiàn)RXR可與9cRA結(jié)合[14, 16], 因此推測(cè)9cRA可能與AiRXR結(jié)合。目前已發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的三丁基錫(TBT) 能夠與人的RXR(hRXR)結(jié)合, 結(jié)合位點(diǎn)位于9cRA結(jié)合區(qū); 疣荔枝螺()的RXR(TcRXR)與hRXR的LBD有相似的空間結(jié)構(gòu), 因此推測(cè)軟體動(dòng)物中TBT可能與TcRXR結(jié)合[17-18]。采用熒光素酶雙報(bào)告技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)TcRXR對(duì)外界的TBT有響應(yīng)[4]。AiRXR是否參與海灣扇貝的三丁基錫應(yīng)激反應(yīng), 尚待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

雙殼類(lèi)貝類(lèi)中存在多種性腺發(fā)育的途徑, 既有雌雄分化也有雌雄同體的形式, 由于性別分化的多樣性, 因此研究雙殼類(lèi)性別分化和性別決定機(jī)制具有重要的價(jià)值[14]。本研究發(fā)現(xiàn)AiRXR在海灣扇貝性腺發(fā)育的5個(gè)時(shí)期均有表達(dá)并且在增殖期表達(dá)最高, AiRXR的表達(dá)趨勢(shì)與雜色鮑的RXR表達(dá)一致[19]。這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明軟體動(dòng)物RXR參與了細(xì)胞增值與分化的過(guò)程, 類(lèi)似脊椎動(dòng)物存在的作用[20], 而且也可據(jù)此推斷RXR在調(diào)節(jié)性腺發(fā)育的過(guò)程發(fā)揮了作用。AiRXR在性腺發(fā)育時(shí)期的各組織中均有表達(dá), 且在性腺中表達(dá)較高, 為AiRXR可能參與調(diào)節(jié)性腺發(fā)育提供了進(jìn)一步的證據(jù)。影響軟體動(dòng)物性腺發(fā)育的溫度、餌料、水質(zhì)等生態(tài)環(huán)境因子是否會(huì)影響RXR的表達(dá), RXR的表達(dá)調(diào)控作用與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性, 還有待進(jìn)一步的研究[21-22]。

4 結(jié)論

本文報(bào)道了海灣扇貝RXR基因的cDNA序列及其在性腺發(fā)育不同時(shí)期的不同組織中的表達(dá)特點(diǎn), 研究結(jié)果有助于闡明海灣扇貝性腺發(fā)育的分子機(jī)制, 豐富軟體動(dòng)物繁殖生物學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)的知識(shí), 為軟體動(dòng)物的性腺分化與發(fā)育分子機(jī)制的研究提供了重要的基礎(chǔ)資料。

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(本文編輯: 梁德海)

Molecular cloning and expression of the retinoid X receptorgene in

ZHangRui1, 2, QUE Hua-yong1, CONG Ri-hao1, LI Li1, ZHANG Guo-fan1

(1. Institute of Oceanology of the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The retinoid X receptor (RXR) is a member of the nuclear family of receptors. It has been proven that RXR plays a crucial role in regulating growth, development, metabolism, and other physiological process in vertebrates. Using the RACE technique, the cDNA sequence ofRXR (AiRXR) was cloned. The ORF of AiRXR was 1338 bp. Two isoforms were confirmed as AiRXRα and AiRXRβ with a difference of four amino acids in the T-box. The homologous analysis of the amino acids showed that AiRXRs share a high degree of similarity with the RXRs ofand. The results of qRT-PCR illustrated that the AiRXR genes are expressed in multiple tissues (mantles, gills, gonads, and adductor muscles) throughout gonadal development, indicating that AiRXRs act as one of the signal molecules involved in multiple physiological processes. The highest level of AiRXR expression was observed at the proliferation stage of gonadal development, implying that AiRXR may be involved in the regulation of gonadal development and differentiation.

; AiRXR gene; tissue expression; gonadal development

Jan. 24, 2016

Q786

A

1000-3096(2016)09-0001-08

10.11759/hykx20160408003

2016-01-24;

2016-06-15

國(guó)家科技部高技術(shù)研發(fā)計(jì)劃課題(863計(jì)劃, 2012AA10A410); 貝類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-48); 中國(guó)科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃項(xiàng)目(KFJ-EW-STS-060)

張瑞(1991-), 女, 滿族, 吉林人, 碩士研究生, 從事海洋生物功能基因研究, 電話: 0532-82898695, Email: 13069312160@163.com; 闕華勇, 通信作者, 研究員, E-mail: hque@qdio.ac.cn

[Foundation: The National High Technology Research and Development Program, 863 Program, No.2012AA10A410; The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System, No.CARS-48; Science and Technology Service Network Initiative No.KFJ-EW-STS-060]