諸氏鯔蝦虎魚卵黃蛋白原基因全長cDNA的克隆及表達

余露軍, 蔡 磊, 李 舸, 陳小曲, 陳 琳, 李建軍

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諸氏鯔蝦虎魚卵黃蛋白原基因全長cDNA的克隆及表達

余露軍, 蔡 磊, 李 舸, 陳小曲, 陳 琳, 李建軍

(廣東省實驗動物監測所廣東省實驗動物重點實驗室, 廣東廣州 510663)

為了探討諸氏鯔蝦虎魚()卵黃蛋白原組織分布及17β-雌二醇(E2)暴露對雄性諸氏鯔蝦虎魚Vg的影響, 作者采用RT-PCR、RACE方法克隆并分析了諸氏鯔蝦虎魚卵黃蛋白原(Vg)基因的全長cDNA序列, 并對Vg在諸氏鯔蝦虎魚體內的組織表達分布及E2誘導后不同時間表達規律進行了研究。結果表明: 獲得的Vg cDNA序列全長5 067 bp, 開放閱讀框(ORF)含4 992 bp, 編碼1 663個氨基酸, 含有信號肽、多絲氨酸區域, 推測其編碼氨基酸分子量為186.2 ku, 等電點為9.31。熒光定量PCR結果顯示, Vg在諸氏鯔蝦虎魚肝臟中表達量最高。E2誘導后, 諸氏鯔蝦虎魚肝臟中Vg mRNA的表達量第1天達到小高峰, 第3天達到高峰, 第7天開始明顯下降, 第11天仍能維持較高水平。本研究成功克隆了諸氏鯔蝦虎魚Vg基因全長cDNA序列, 諸氏鯔蝦虎魚肝臟是Vg主要合成場所, E2誘導雄性諸氏鯔蝦虎魚Vg的表達作為生物標志物用于近海環境雌激素類物質的檢測具有良好的應用前景。

諸氏鯔蝦虎魚(); 卵黃蛋白原; cDNA全長; 熒光定量PCR; 17b-雌二醇

卵黃蛋白原(Vitellogenin, Vg)是幾乎所有卵生動物中卵黃蛋白(Vitellins, Vn)的前體[1], 為雌性動物特有的蛋白, 在雄性動物體內含量極低或完全沒有, 但在雌激素類物質的的誘導下, 雄性動物也能合成卵黃蛋白原[2], 這種受雌激素類物質誘導的特性, 使得卵黃蛋白原被廣泛地應用于環境內分泌干擾物的毒性評價, 已成為外源雌激素和內分泌干擾物毒理研究的理想生物標志物[3]。

魚類是水環境生態鏈中重要的一環, 是理想的水環境污染物監測生物, 目前已有多種魚類用于環境雌激素的研究[4-5], 其中斑馬魚()[6]、劍尾魚()[7]、唐魚()[8]、青鳉()[9]等多種魚類實驗動物在卵黃蛋白原(Vg)水平開展了相關的研究。河口與近海水域是陸地水流與海洋的交匯處, 也是環境污染物的匯聚地, 但河口魚類在環境雌激素效應方面的研究較少。諸氏鯔蝦虎魚() 屬于鱸形目(Perciformes), 蝦虎魚科(Gobiidae), 鯔蝦虎魚屬(), 為暖水性底層小型魚類, 棲息于河口、咸淡水水域中, 具有體形小、適應鹽度范圍廣、對許多毒物敏感性強的特點[10]。諸氏鯔蝦虎魚作為一種海洋水生實驗動物, 已開展海洋污染物的相關毒性評價[11-12]。本研究以諸氏鯔蝦虎魚為實驗材料, 克隆了諸氏鯔蝦虎魚Vg基因全長cDNA序列, 并對Vg在諸氏鯔蝦虎魚體內的組織分布及雌激素誘導后不同時間表達規律進行了研究, 為諸氏鯔蝦虎魚應用于近海環境雌激素類污染物的監測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗用諸氏鯔蝦虎為本實驗室內繁殖的子9代封閉群(4~5月齡), 半靜態方式養殖, 體長23~34 mm,水質條件為鹽度25±2, 溫度(26±2)℃, 光周期14 h︰10 h (光照︰黑暗)。

1.2 諸氏鯔蝦虎魚Vg全長cDNA擴增及序列分析

總RNA提取: 取3尾雌性諸氏鯔蝦虎魚新鮮肝臟組織并混合, 按Trizol(Invitrogen)試劑盒說明書提取總RNA, 超微量分光光度計(NanoDrop 2000C, Thermo Scientific)測定RNA純度和濃度, 計算加入的RNA樣本量(Total RNA 400 ng), 按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒說明書進行反轉錄合成第一鏈cDNA。

Vg cDNA克隆: 根據GenBank中已知魚類黃鰭刺蝦虎魚()(AB088473.1)Vg-530cDNA序列, 合成1對引物PVg(表1)。以第一鏈cDNA為模板, 進行PCR擴增, 根據獲得的Vg基因片段分別設計5′RACE下游巢式引物5′GSP 外側和5′GSP 內側、3′RACE上游巢式引物 3′GSP 外側和3′GSP 內側(表 1), PCR擴增方法參照劉春等[13]的方法進行, PCR產物經膠回收 (Omega) 純化后與pMD-19T載體( Takara) 連接, 挑取陽性克隆送上海生工測序。

表1 引物序列

序列分析: 測序獲得的序列用DNAstar7.1分析軟件進行全長拼接, 在GenBank數據庫與已知魚類Vg氨基酸序列進行同源性比較分析, 用MEGA4.0軟件構建系統發育進化樹。采用在線翻譯工具( http: //www.expasy.ch) 對序列進行翻譯和蛋白質組分析[14]。

1.3 諸氏鯔蝦虎魚不同組織器官中Vg的表達

隨機挑選3尾雌性諸氏鯔蝦虎魚(4~5月齡), 分別取肝、脾、腸、鰓、肌肉、腦、卵巢組織, 取3個平行樣品, 按1.2中的方法進行總RNA提取和反轉錄合成第一鏈cDNA。

根據諸氏鯔蝦虎魚Vg基因cDNA序列, 用Primer Premier5.0設計熒光定量檢測引物RT-Vg和內參基因β-actin的引物RT-act(表1), 采用熒光定量PCR技術(ABI 7500)對諸氏鯔蝦虎魚肝、脾、腸、鰓、肌肉、腦、卵巢組織(=3)中的Vg表達情況進行檢測, 并以b-actin為內參基因對數據進行分析[13]。實驗數據采用spss17.0軟件進行顯著性差異分析, excel軟件作圖。

1.4 雌激素誘導不同時間諸氏鯔蝦虎魚肝臟中Vg的表達

挑選已具備性特征的雄性諸氏鯔蝦虎魚(4~5月齡)暴露于100 μg/L的β-雌二醇[13](溶解于無水乙醇), 每組20尾, 每組3個平行, 同時設置海水對照組, 對照組加入同樣濃度的無水乙醇(終濃度<0.01%)。暴露時間為11 d, 每天更換一次試液。每天投喂適量鹵蟲()無節幼體, 分別在1、3、5、7、9、11 d取3尾魚肝臟組織混合, 凍存于液氮中。

按1.2中的方法對上述樣品進行總RNA提取和反轉錄合成cDNA模板, 采用熒光定量PCR技術對雌激素誘導后諸氏鯔蝦虎魚肝臟中的Vg進行檢測, 檢測方法和數據分析同1.3。

2 結果

2.1 諸氏鯔蝦虎魚Vg基因cDNA 序列擴增及結構分析

用DNAStar軟件對PCR擴增獲得的諸氏鯔蝦虎魚Vg基因核心片段、3′端、5′端序列片段進行拼接, 獲得諸氏鯔蝦虎魚Vg基因的全長 cDNA 序列。該序列全長5067 bp, 包含起始密碼子ATG、終止密碼子TAG及加尾信號AATAAA, 在GenBank庫中的登錄號為KP162167。鯔蝦虎魚卵黃蛋白原基因cDNA序列含有一個完整的開放閱讀框(ORF), 編碼1663個氨基酸, N-端的前15個氨基酸為信號肽, 有4個糖基化位點, 其中2個可能是有效的糖基化位點在112~114, 1133~1135。序列還含有一個多聚絲氨酸區(氨基酸位點在1088~1187)。根據推算, 其編碼的蛋白分子量為186.2 ku, 等電點為9.31。該基因的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列如圖1。

信號肽位置用水平線標出, 陰影部分為多聚絲氨酸區域, 黑色框為加尾信號

The signal peptide site of vitellogenin is marked by the horizontal line, polyserine domain is indicated by shading, polyadenylation signal is indicated by black border

2.2 諸氏鯔蝦虎魚Vg基因氨基酸同源性比對及系統進化樹分析

諸氏鯔蝦虎魚Vg基因編碼的氨基酸序列在GenBank數據庫中進行檢索、比對, 結果顯示與同屬于蝦虎魚科的黃鰭刺蝦虎魚(BAC06190.1)、矛尾刺蝦虎魚(AAV84912.1)同源性最高, 均為73%, 與小長臂蝦虎魚(AGO64301.1)、北方藍鰭金槍魚()(ACX32463.1)、金頭鯛()(CDK37743.1)氨基酸同源性分別為59%、52%、50%, 與其他幾種魚類氨基酸同源性為47%~43%(表2)。選取GenBank數據庫中15種硬骨魚類的Vg基因氨基酸序列, 利用MEGA4.0軟件構建系統進化樹, 分子進化分析表明, 諸氏鯔蝦虎魚與黃鰭刺蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚聚為一支, 親緣關系最近(圖2)。

表2 諸氏鯔蝦虎魚與其他魚類Vg基因氨基酸同源性比較

節點處數值為自展置信值, 自展重復1000次

The degree of confidence for each branch point was determined by bootstrap analysis (1000 repetitions)

2.3 Vg在諸氏鯔蝦虎魚的組織分布

利用熒光定量RT-PCR方法對雌性諸氏鯔蝦虎魚7個組織中Vg的表達情況結果如圖3所示。諸氏鯔蝦虎魚Vg在肝臟中相對表達量最高, 脾、腸中有極微量表達(均小于肝臟表達量的1%), 鰓、腦、肌肉、卵巢中幾乎沒有檢測到表達, 肝中的相對表達量顯著高于其他各組織中的相對表達量相比(<0.01)。

2.4 雌激素誘導后諸氏鯔蝦虎魚肝臟中Vg的表達規律

雌激素誘導雄性諸氏鯔蝦虎魚, 不同時間肝臟中Vg的相對表達結果如圖4。由圖可知, 在試驗期間內, E2誘導后各時間點諸氏鯔蝦虎魚肝臟中Vg的相對表達量在雌激素誘導后均顯著高于對照組(< 0.01); 諸氏鯔蝦虎魚肝臟中Vg相對表達量第1天即達到小高峰, 第3天相對表達量顯著高于第1天相對表達量, 達到高峰(<0.01); 第7天開始明顯下降, 相對表達量顯著低于第5天相對表達量(<0.05); 至第11天仍能維持較高水平, 但與第7天相比沒有顯著性差異(>0.05)。

a. 與對照組相比差異極顯著(<0.01); b. 與前一時間點相比差異顯著(<0.05); c. 與前一時間點相比差異極顯著(<0.01)

a. extremely significant difference compared with the control group (<0.01); b. significant difference compared with the former point (<0.05); c. extremely significant difference compared with the former point (<0.01)

3 討論

3.1 諸氏鯔蝦虎魚Vg基因結構分析

卵黃蛋白原基因大都起源于一個共同的祖先基因, 不同氨基酸功能區域進化速度存在較大差異, 既含進化較快的富含絲氨酸區域, 也有進化速度極慢的高保守結構區域[15]。在種間進行系統進化分析時能表現出很高的分辨率, 因此可以用于進化關系較近的物種間的系統進化研究[16]。本實驗從雌性諸氏鯔蝦虎魚肝組織中克隆得到5 067 bp的Vg基因全長cDNA序列, 該序列ORF編碼的氨基酸序列與GenBank中登陸的15種魚類Vg的ORF比對, 與同屬于蝦虎魚科的黃鰭刺蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚同源性最高為73%, 與其他13種魚類同源性為59%~ 43%。以擴增得到的諸氏鯔蝦虎魚Vg氨基酸序列與15種魚類Vg氨基酸序列構建進化樹, 進行系統進化分析, 諸氏鯔蝦虎魚與同為蝦虎魚科的黃鰭刺蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚聚為一支, 其親緣關系較近, 上述結果表明, 本實驗成功克隆了諸氏鯔蝦虎魚Vg全長cDNA序列。

Vg基因是由多個基因編碼的相關蛋白組成的一個多基因家族, 魚類也被證實存在多種形式的Vg[15, 17]。由于 Vg 結構和功能的多樣性, 目前Vg沒有統一的命名和分類規則, Hiramatsu等[18]根據Vg 結構氨基端脂磷蛋白重鏈(LvH)-高磷蛋白-脂磷蛋白輕鏈(LvL)-β組分-羧基端編碼序列 (β-c)的區別, 將Vg分為 VgA、VgB和VgC 3類。在不同種類的魚類中, Vg 分子結構同樣具有多樣性, 根據卵細胞中降解程度的差異可分為VgA 和 VgB, 但都具有完整的PV結構, VgC結構中則缺乏 PV結構或PV結構較短, 分子量也較小[19]。本研究所得的諸氏鯔蝦虎魚Vg序列編碼1663個氨基酸, 明顯多于劍尾魚VgC(1250 aa)、小長臀蝦虎魚VgC(1238aa)編碼的氨基酸序列, 且該序列ORF編碼的氨基酸序列在GenBank中比對結果顯示, 與其編碼的氨基酸序列相似性最高的前10種魚類, 除黃鰭刺蝦虎魚、矛尾刺蝦虎魚Vg沒有明確分類外, 其余魚類均為VgA, 因此所得序列可能為諸氏鯔蝦虎魚VgA。

3.2 諸氏鯔蝦虎魚Vg mRNA表達的組織分布

卵黃蛋白原有內源性卵黃蛋白原合成和外源性卵黃蛋白原合成兩種合成方式, 在卵生脊椎動物中, Vg在肝臟內合成, 通過血液循環運輸至卵巢, 最后儲存在卵母細胞中為胚胎發育提供能量[20-21]。目前多數研究認為肝臟是魚類卵黃蛋白原合成組織, 魚類主要進行外源性的卵黃蛋白原合成。Yan等[22]發現斑馬魚和青鳉Vg A基因只在雌魚肝臟中表達, 在肌肉、腸、卵巢中均無發現。劉春等[13]研究表明, 肝是劍尾魚Vg C主要合成場所, 表達量最高, 脾、腎、卵巢有微量表達, 腦、肌肉、鰓幾乎無表達。本研究用熒光定量PCR方法對諸氏鯔蝦虎魚雌魚7個組織器官進行了Vg mRNA表達量的檢測, 結果顯示Vg mRNA在肝臟中表達量最高, 脾、腸中有極微量表達(<1%), 鰓、腦、肌肉、卵巢中幾乎沒有檢測到表達, 表明肝臟是諸氏鯔蝦虎魚Vg合成的主要場所。

3.3 雌二醇誘導后的雄性諸氏鯔蝦虎魚Vg mRNA表達規律

Vg是包括魚類在內的雌性動物特有的一種蛋白,但在雌激素誘導下雄魚也能產生該蛋白[23], 魚類體內Vg這種特性, 使其成為檢測外源雌激素和內分泌干擾物的最為普遍的方法之一[24], 多種魚類開展了水環境雌激素效應相關的研究。劉春等[13]研究發現, 100mg/L的17b-雌二醇(E2)誘導雄性劍尾魚后, 肝臟Vg mRNA相對表達量在誘導后第1天達到小高峰, 第5天達到高峰, 第9天后維持相對低的表達量。Yan等[22]研究表明, 1mg/L E2誘導后的斑馬魚Vg A mRNA在第2天達到小高峰, 在30 d達到高峰, 0.1mg/L E2誘導后的青鳉Vg A mRNA在第3天和12天達到高峰。黃曄等[6]用250 ng/L E2誘導雄性斑馬魚, 第4天肝臟Vg mRNA才檢測到表達。劍尾魚、斑馬魚、青鳉Vg mRNA表達規律不一致, 除物種不同外, 還可能為E2誘導濃度不同所致。本研究中諸氏鯔蝦虎魚Vg mRNA表達規律與劍尾魚研究結果相似, 但諸氏鯔蝦虎魚肝臟Vg mRNA表達高峰維持時間更長, 這可能與魚的種類有關。本實驗結果證明, 雌二醇能顯著誘導雄性諸氏鯔蝦虎魚Vg的表達, 諸氏鯔蝦虎魚體內Vg作為生物標志物用于近海環境雌激素類物質的檢測具有良好的應用前景。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Full-length cDNA cloning and expression analysis of vitellogenin gene in

YU Lu-jun, CAI Lei, LI Ge, CHEN Xiao-qu, CHEN Lin, LI Jian-jun

(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Key Laboratory of Guangdong Laboratory Animals, Guangzhou 510663, China)

To explore the tissue distribution of the vitellogenin (Vg) gene inand the effect of the pollutant 17β-estradiol on male, the full length of vitellogenin (Vg) cDNA inwas cloned by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) techniques using total RNA extracted from the liver of female fish. Meanwhile, the expression of Vg mRNA ofwas determined by real-time fluorescent quantitative PCR. The full length of’s Vg cDNA sequence contains 5 067 bp nucleotides, with a complete open reading frame (ORF) of 4 992 bp, which encodes 1 664 amino acid proteins with a deduced protein molecular weight of 186.2 ku. The ORF contains signal peptides and a polyserine domain. The real-time RT-PCR result showed that’s Vg mRNA was primarily detected in the liver. Furthermore, Vg mRNA expression levels at different time points of E2 treatment of male fish were determined.’s Vg mRNA expression levels reached the peak on the third day and then the expression levels declined on the seventh day. These results indicated that the full length of Vg cDNA inwas cloned successfully. This study suggests that Vg in malecan be considered as a valid biomarker for offshore environmental monitoring of estrogenic substances.

; vitellogenin; full-length cDNA; quantitative real-time RT-PCR; 17β-estradiol

Feb. 1, 2015

X171; S917

A

1000-3096(2016)09-0023-09

10.11759//hykx 20150201004

2015-02-01;

2015-04-27

國家科技支撐計劃項目(2013BAK11B902); 廣東省科技計劃項目(2011B010500021, 2012B040302006)

余露軍(1982年-), 男, 湖南岳陽人, 工程師, 碩士, 主要從事水生實驗動物及其病害方面的研究, 電話: 020-84106815, E-mail: ljyu1212@163.com; 李建軍, 通信作者, E-mail: lijianjun1125@126.com

[Foundation: National Key Technology Support Program (2013BAK11B902);Science and Technology Program of Guangdong Province (2011B010500021, 2012B040302006)]