基于線粒體16S rRNA基因序列對3種珍珠貝的鑒定

劉國強, 劉 銳, 魏春雷, 張春華

?

基于線粒體16S rRNA基因序列對3種珍珠貝的鑒定

劉國強1, 劉 銳2, 魏春雷1, 張春華1

(1. 國家海洋局北海海洋環(huán)境監(jiān)測中心站, 廣西北海 536000; 2. 河北省邯鄲市環(huán)境保護局, 河北邯鄲 056002)

傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定主要依賴于分類者的經(jīng)驗和水平, 容易產(chǎn)生分類錯誤。為提高物種鑒定的準確性, 作者采用形態(tài)學與線粒體16S rRNA基因序列分析相結(jié)合的方式對廣西北海潿洲島采獲的3種珍珠貝進行了鑒定。研究結(jié)果表明, 基于形態(tài)學可將3種珍珠貝分別鑒定為企鵝珍珠貝()、寬珍珠貝()和中國珍珠貝(), 但基于16S rRNA基因序列, 形態(tài)學鑒定為的標本應為.。和.是兩個完全獨立的種, 并非為同物異名。珍珠貝屬16S rRNA基因序列的種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離, 適宜作為該屬種類鑒定的分子標記。在基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹中, 相同種類的不同個體均形成單系群, 并獲得很高的支持率。分布于中國沿海的珍珠貝屬種類應包括, 是否有的分布尚需進一步證實。

珍珠貝屬(); 16S rRNA基因; 種類鑒定

珍珠貝屬()隸屬珍珠貝目(Pterioida)、珍珠貝科(Pteriidae), 是一類具有重要經(jīng)濟價值的貝類, 中國沿海共分布有12種[1–2]。其中, 寬珍珠貝起初被王禎瑞[3]定為., 但隨后又將.視為的同物異名[2], 此后國內(nèi)許多學者[4–6]沿用了這一種名。而T?mkin[7]認為.和為兩個完全獨立的種, 且能通過DNA序列加以區(qū)分。因此, 在中國分布的究竟是.還是, 或是兩者兼而有之, 還未有相關(guān)研究的證實。

當前, 貝殼形態(tài)特征仍然是貝類分類的主要依據(jù)。然而, 貝殼形態(tài)會隨環(huán)境變化產(chǎn)生差異, 許多種內(nèi)變異很大或一些種間差異并不明顯, 進而導致標本難以準確鑒定[8]。分子生物學技術(shù)不僅廣泛應用于貝類的系統(tǒng)發(fā)育研究[7, 9-10], 在種類鑒定和區(qū)分上也具有重要應用價值[8, 10-12]。作者以采自廣西潿洲島海域的3種珍珠貝屬種類為材料, 通過測定其線粒體16S rRNA基因序列對其進行鑒定, 并結(jié)合GenBank中下載的其他珍珠貝屬種類序列分析了該屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 以期為其他研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

作者所用的中國珍珠貝()、.和企鵝珍珠貝() (圖1)采自廣西潿洲島海域, 樣品數(shù)分別為2、1和3個。樣品冷凍保存帶回實驗室后, 取其腹足肌保存于無水乙醇中, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取和PCR擴增

采用CTAB法提取樣品總DNA[13], 使用引物16sar-L(5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3′)和16sbr-H(5′-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′)[14]擴增線粒體16S rRNA基因片段。

PCR反應體系總體積為50 μL, 其中:10×buffer 5 μL, dNTP 200 μmol/L, 引物各0.3 μmol/L, Taq酶1.5 U, 模板DNA 1 μL, 加去離子水補足至50 μL。PCR反應條件為:94℃預變性2 min; 94℃變性30 s, 52℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 共35個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收純化, 然后進行雙向測序, 測序引物與擴增引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)樹構(gòu)建

采用Bioedit 7.0.1 軟件進行序列拼接, 并輔以手工校對。合并從GenBank 下載的數(shù)據(jù), 利用ClustalX1.8.3 軟件對序列進行多重比對。采用MEGA 5.10分析序列的堿基組成以及基于Kimura雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter, K2P)的遺傳距離, 并利用該軟件中的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 可靠性經(jīng)過1 000次自展(bootstrap)檢驗。文中僅在系統(tǒng)樹上標注出大于50%的自展支持率。

a–b. 中國珍珠貝; c–d..; e–f. 企鵝珍珠貝; 比例尺=1 cm

a–b.; c–d.; e–f.; scale bar 1 cm

2 結(jié)果

2.1 堿基組成

序列提交GenBank, 獲得登錄號KT205283- 205288。3種珍珠貝的序列長度為495 bp ~529 bp (不包括引物區(qū))。連同GenBank下載的9條珍珠貝屬序列一起分析堿基組成, 珍珠貝屬16S rRNA基因的A、T、G、C平均比例分別為25.5%、28.6%、29.5%和16.4%, A+T的比例較高。

2.2 遺傳距離

珍珠貝屬16S rRNA基因種內(nèi)的平均遺傳距離為0~0.005(范圍0~0.011), 種間的平均遺傳距離為0.088~0.227, 種內(nèi)與種間的遺傳距離差異明顯(表1)。和之間的種間遺傳距離最小, 為0.008;和之間的種間遺傳距離最大, 達0.227。作者測得的序列與GenBank中已有的序列(登錄號HQ329435)完全相同。

表1 珍珠貝屬種類的種內(nèi)及種間平均遺傳距離

注:“/”表示僅1個個體, 無遺傳距離

2.3 系統(tǒng)學分析結(jié)果

以為外群, 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建了NJ樹(圖2), bootstrap支持率高于50%的標注在節(jié)點處。由圖2可見, 所有相同種類的不同個體均形成單系, 并獲得很高的支持率。珍珠貝屬的種類在NJ樹中明顯可分為2個支系, 支系Ⅰ包括和, 支系Ⅱ包括、、、和, 但兩個支系獲得的支持率較低(<50%)。

黑體顯示的序列號為本研究測得

Accession numbers in bold are sequenced in this study

3 討論

海洋貝類是種類十分豐富的一大類群, 貝殼形態(tài)各異, 顏色豐富多彩, 鑒定難度較大。貝殼的殼形、殼色等是種類鑒定和區(qū)分的主要依據(jù), 但這些特征會因為形態(tài)可塑性、趨同進化、性別以及生長發(fā)育階段的不同而出現(xiàn)變化, 如蜘蛛螺屬()成體和幼體貝殼的形態(tài)差異很大[15], 脈紅螺()也會因棲息海區(qū)和底質(zhì)環(huán)境等因素的不同導致形態(tài)變異較大[16]。

作者采集到的標本與國內(nèi)其他學者[2–6]所描述的或在形態(tài)學上基本一致, 可以斷定它們應屬于同一個種。作者的標本在腹緣上具有較多的小棘刺, 這一特征在國內(nèi)其他學者所描述的標本中并未見到。基于線粒體16S rRNA基因序列的分析結(jié)果表明, 國內(nèi)記錄到的種類應為而非, 中國沿海是否有的分布尚需進一步證實。珍珠貝屬16S rRNA基因序列的種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離, 適宜作為該屬種類區(qū)分的標記。

形態(tài)鑒定是當前海洋生物多樣性監(jiān)測工作的主要手段, 監(jiān)測數(shù)據(jù)的質(zhì)量直接取決于鑒定者的水平和經(jīng)驗。而目前專業(yè)的分類人才極度匱乏, 已成為監(jiān)測工作的短板。中國已連續(xù)多年開展海洋生態(tài)監(jiān)控區(qū)的生物多樣性監(jiān)測工作, 取得了大量的數(shù)據(jù), 但是仍然缺少完整的生物物種組成準確名錄與分布記錄, 不能滿足多樣性全面分析比較的需要[17]。不同鑒定者之間或是不同年份之間的數(shù)據(jù)可比性較差。傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定和分子生物學技術(shù)相結(jié)合, 會極大地提高物種鑒定的準確性, 提升生物多樣性監(jiān)測的水平。

參考文獻：

[1] 劉瑞玉. 中國海洋生物名錄[M]. 北京: 科學出版社, 2008: 557. Liu Ruiyu. Checklist of marine biota of China seas[M]. Beijing: Science Press, 2008: 557.

[2] 王禎瑞. 中國動物志[M]. 北京: 科學出版社, 2002: 98-116. Wang Zhenrui. Fauna Sinica[M]. Beijing: Science Press, 2002: 98-116.

[3] 王禎瑞. 中國近海珍珠貝科的研究[J]. 海洋科學集刊, 1978, 14: 101-115. Wang Zhenrui. A study of the Chinese species of the family Pteriidae (Mollusca)[J]. Studia Marina Sinica, 1978, 14: 101-115.

[4] 徐鳳山, 張素萍. 中國海產(chǎn)雙殼類圖志[M]. 北京: 科學出版社, 2008:66-67. Xu Fengshan, Zhang Suping. An illustrated bivalvia mollusca fauna of China Seas[M]. Beijing: Science Press, 2008: 66-67.

[5] 楊文, 蔡英亞, 鄺雪梅. 中國南海經(jīng)濟貝類原色圖譜[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2012: 170-172. Yang Wen, Cai Yingya, Kuang Xuemei. Color altas of economic mollusca from the South China sea[M]. Beijing: China Agricultural Press, 2012: 170-172.

[6] 鄭小東, 曲學存, 曾曉起, 等. 中國水生貝類圖譜[M]. 青島: 青島出版社, 2013: 399. Zheng Xiaodong, Qu Xuecun, Zeng Xiaoqi, et al. Atlas of aquatic molluscs in China[M]. Qingdao: Qingdao Publishing House, 2013: 399.

[7] T?mkin I. Molecular phylogeny of pearl oysters and their relatives (Mollusca, Bivalvia, Pterioidea) [J]. BMC Evolutionary Biology, 2010, 10: 342.

[8] 張亮, 黃艷艷, 劉煥章. 利用mtDNA 16S rRNA序列差異鑒定江西青嵐湖的河蚌物種[J]. 水生生物學報, 2004, 28(3): 294-299.Zhang Liang, Huang Yanyan, Liu Huanzhang. The species identification of mussels in Qinglan Lake (Jiangxi Province) based on sequences of mitochondrial 16S Rrna gene[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2004, 3: 294- 298.

[9] Matsumoto M. Phylogenetic analysis of the subclass Pteriomorphia (Bivalvia) from mtDNA COI sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2003, 27: 429- 440.

[10] 喻達輝, 朱嘉濠, 賈曉平. 我國珠母貝屬()主要種類親緣關(guān)系的初步分析[J]. 海洋與湖沼, 2006, 37(3): 211-217.Yu Dahui, Chu Kahou, Jia Xiaoping. Preliminary analysis on genetic relationship of common pearl Oysters ofin China[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2006, 37(3): 211-217.

[11] 喻達輝, 朱嘉濠. 珠母貝屬6個種的ITS2分子標記研究[J]. 南方水產(chǎn), 2005, 1(4): 7-12.Yu Dahui, Chu Kahou. Study on ITS 2 molecular markers of six pearl oyster species in the genus[J]. South China Fisheries Science, 2005, 1(4): 7- 12.

[12] 溫海洋, 石耀華, 顧志峰, 等. 海南珠母貝屬() 6個種的分類鑒定[J]. 熱帶生物學報, 2014, 5(1): 1-7. Wen Haiyang, Shi Yaohua, Gu Zhifeng. Classification and identification of sixspecies in Hainan Province[J]. Journal of Tropical Biology, 2014, 5(1): 1-7.

[13] Williams S T, Reid D G, Littlewood D T. A molecular phylogeny of the Littorininae (Gastropoda: Littorinidae): unequal evolutionary rates, morphological parallelism, and biogeography of the Southern Ocean[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2003, 28: 60-86.

[14] Simom C, Frati F, Beckenbach A, et al. Evolution, weighting and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers[J]. Annals of the Entomological Society of America, 1994, 87: 651–701.

[15] 張素萍. 中國海洋貝類圖鑒[M]. 北京, 海洋出版社, 2008: 86-87. Zhang Suping. Atlas of marine mollusks in China[M]. Beijing: Ocean Press, 2008: 86-87.

[16] 班紹君, 薛東秀, 張濤, 等. 三種殼口顏色脈紅螺()形態(tài)學和線粒體16S rRNA與COI基因片段差異比較分析[J]. 海洋與湖沼, 2012, 43(6): 1209-1217. Ban Shaojun, Xue Dongxiu, Zhang Tao, et al. Variance analysis of three color morphs ofbased on morphological traits and mt16S rRNA and COI partial sequences[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2012, 43(6): 1209-1217.

[17] 劉瑞玉. 中國海物種多樣性研究進展[J]. 生物多樣性, 2011, 19(6): 614-626. Liu Ruiyu. Progress of marine biodiversity studies in China seas[J]. Biodiversity Science, 2011, 19(6): 614- 626.

(本文編輯: 譚雪靜)

Species identification of threespecies based on mitochondrial 16S rRNA gene

LIU Guo-qiang1, LIU Rui2, WEI Chun-lei1, ZHANG Chun-hua1

(1. Marine Environmental Monitoring Center of Beihai, State Oceanic Administration, Beihai 536000, China; 2. Handan Municipal Bureau of Environmental Protection, Handan 056002, China)

Species identification based on morphology highly relies on the ability of taxonomists. Some species can be easily misidentified based on morphological characteristics alone. To improve the accuracy of species identification, threespecies sampled from Weizhou Island, Guangxi, were identified based on shell morphology and mitochondrial 16S rRNA gene sequences. These three species were identified as,and, respectively, based on shell morphology. However, the specimen that was identified asbased on morphological characteristicswas later identified as.using 16S rRNA gene sequences.and.are two distinct species and are not synonyms. The genetic distances are much higher between species than within species, indicating that 16S rRNA gene is useful for species identification in the genus..is a valid species, andexists in China, with no further confirmation required.

; 16S rRNA gene; species identification

Jul. 9, 2015

Q959.212

A

1000-3096(2016)09-0018-05

10.11759//hykx20150709003

2015-07-09;

2015-12-03

國家自然科學基金項目(41306132)

劉國強(1979–), 男, 山東昌邑人, 碩士, 高級工程師, 主要從事海洋生物多樣性監(jiān)測與評價研究, E-mail: liuguoqiang0821@ 163.com

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 41306132]