胚胎培養液中血管內皮生長因子的水平及其與IVF-ET結局的關系

任建枝，蔡嘉力，韓冬梅，李 萍，耿 潔，馬彩輝，韓 艷

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·論 著·

胚胎培養液中血管內皮生長因子的水平及其與IVF-ET結局的關系

任建枝，蔡嘉力，韓冬梅，李 萍，耿 潔，馬彩輝，韓 艷

目的 探討體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療患者胚胎培養液中血管內皮生長因子水平與早期胚胎質量及胚胎移植后臨床結局的關系。方法 留取第3天胚胎培養液，采用酶聯免疫吸附試驗檢測培養液中血管內皮生長因子(VEGF)的水平。結果 ①兩組患者的平均年齡、獲卵數、胚胎數、優胚數及移植胚胎的累積胚胎評分均無明顯差異(P>0.05)，妊娠組卵泡液內VEGF 水平顯著低于非妊娠組(P<0.05)。②Ⅰ級胚胎培養液中VEGF水平明顯低于Ⅱ級胚胎培養液中VEGF水平(P<0.01)。結論 胚胎培養液中VEGF的水平可以作為預測胚胎質量及妊娠結局的參考指標之一。

血管內皮生長因子；胚胎質量；改良長方案

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種多功能生長因子和特異性血管生長因子，具有特異性促血管內皮細胞有絲分裂，強烈誘發活體內新血管形成。參與多種生理活動，并在一些疾病的發病機制中起重要作用[1]。我們的既往研究表明，在排卵周期中，隨著卵泡的增大成熟，血清及卵泡液中VEGF水平也明顯增高，提示VEGF可能參與卵泡的發育[2]。然而對于VEGF在人的胚胎發育過程中的相關研究尚鮮有報道，我們試圖通過測定接受體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)治療患者的卵裂期單胚胎培養液中VEGF水平, 并分析胚胎培養液中VEGF水平及胚胎移植后臨床結局的關系,為今后選擇移植胚胎時提供有價值的參考指標。

1 對象與方法

1.1 對象 2014年10-12月在解放軍174醫院生殖醫學中心接受IVF-ET治療的80例患者，其中原發性不孕39例、繼發性不孕41例，年齡(30.95±4.23)歲,體重指數(BMI)為(21.16±2.14)，所有患者均符合IVF-ET適應證。

1.2 樣本收集及處理 均采用本中心的常規促排卵方案-改良方案促排卵[3]，經陰道B超引導下穿刺取卵，精液處理后選擇常規體外受精，加精后19 h觀察受精。受精后，將受精卵轉移到胚胎培養微滴，采用一個胚胎一個培養滴的微滴培養，胚胎培養置37 ℃、6%CO2培養箱培養。48 h觀察胚胎進行胚胎評分。選擇最好的2個胚胎進行移植。轉移胚胎后將胚胎培養液，2030 μL/滴分裝，-80 ℃超低溫冰箱保存待檢測。

1.3 移植胚胎累積胚胎評分 培養第3 天行胚胎評分，根據卵裂球的細胞數量、細胞是否均勻及是否有碎片，按Wetzels胚胎評分法[4]:①Ⅰ級胚胎(4分):細胞均勻,形狀規則,透明帶完整，胞質均勻清晰，細胞碎片在5%；②Ⅱ級胚胎(3分):細胞大小不均勻,形狀略不規則，胞質可有顆粒現象，細胞碎片在10%～20%;③Ⅲ級胚胎(2分):細胞大小明顯不均勻, 形狀明顯不規則，胞質可有顆粒現象，細胞碎片在21%～50%;④Ⅳ級胚胎(1分):細胞極不均勻,胞質可有嚴重顆粒現象,碎片在50%上;⑤Ⅴ級胚胎(0分)：退化、死亡胚胎。胚胎的形態評分乘以胚胎細胞數,得到每個胚胎的分數，移植周期移植胚胎分數的總和得到每個患者移植周期的累積胚胎評分(cumulative embryo score，CES)。

1.4 分組 根據臨床結局分為臨床妊娠組與非妊娠組。臨床妊娠的診斷方法是胚胎移植后4 周行超聲檢查見妊娠囊及胎芽、原始心管搏動或刮宮見到絨毛者。

1.5 培養液中VEGF的檢測 培養液液中VEGF濃度采用ELISA法測定，測定所用試劑為VEGF試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司),并做預試驗以調整稀釋比例。

2 結 果

2.1 不同臨床結局患者間相關指標的比較 80例行胚胎移植者獲妊娠48 例，妊娠率為60.00%。妊娠組為48 例，非妊娠組為32 例。兩組患者的平均年齡、不孕年限、既往移植次數、基礎的促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone,FSH)水平、黃體生長素(luteinizing hormone，LH)水平、絨毛膜促性激素(human chorionic gomadotropin,HCG) 日內膜厚度、雌激素(estradiol,E2)水平、孕激素(progesterone,P)水平、獲卵數、胚胎數、優胚數、優質胚胎率及移植胚胎的累積胚胎評分均無明顯差異(P>0.05)，妊娠組胚胎培養液內VEGF 水平明顯低于非妊娠組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同臨床結局患者間相關指標的比較(±s)

2.2 不同質量胚胎的胚胎培養液中VEGF水平 Ⅰ級胚胎(4分) 培養液中VEGF水平為(7.65±3.92)pg/mL，Ⅱ級胚胎(3分) 培養液中VEGF水平為(16.46±3.34) pg/mL。具有更良好著床潛能的Ⅰ級胚胎對應的卵胚胎培養液中VEGF水平比胚胎質量稍差的Ⅱ級對應的卵胚胎培養液中VEGF水平明顯低，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討 論

3.1 胚胎質量評判的方法及局限性 胚胎質量是妊娠成功的關鍵因素之一，在目前的人類輔助生殖技術中，胚胎的形態學參數仍作為挑選胚胎的主要非侵入性指標。形態學的評估雖然對于挑選胚胎進行移植提供了簡便有效的方法，然而，不少通過形態學方法評估為優質胚胎移植后卻未能著床。目前胚胎形態學評估存在諸多問題，如缺少可量化的指標、受到實驗室技術人員主觀因素的影響。因此如何增加預測方法、提高預測早期胚胎發育潛能的能力成為當務之急。測量胚胎代謝產物中胚胎內源性因子來評估胚胎發育潛能因其非侵入性、風險低等優點而可能成為評估胚胎質量的有效方法。早年，Risau[5]在動物實驗中發現VEGF作為血管形成關鍵的始動因子作用于早期的誘生階段，誘導血管內皮細胞分裂增生，形成原始血管，再通過血管生成素1和酪氨酸蛋白激酶B2的協同作用使該血管重塑而成熟, 從空間、時間、數量的不同角度敏感地調節血管生長。在小鼠體外胚胎培養過程中去除VEGF，胚胎發育遲緩甚至停止，再加入VEGF后，胚胎發育恢復正常并可見心血管形成[6]。近年來在豬的未成熟卵母細胞體外培養及體外受精的研究中發現[7]，培養液中加入VEGF組的卵母細胞體外成熟率、受精率及囊胚形成率均高于未加入組。而對于VEGF在人的胚胎發育過程中的相關研究尚鮮有報道。

3.2 不同臨床結局組的胚胎培養液中VEGF水平 既往的研究認為IVF的臨床妊娠與患者的年齡、胚胎質量、子宮內膜的容受性有關[8]。但本研究結果顯示: 在妊娠組與非妊娠組患者的臨床特征(平均年齡、不孕年限、促性腺激素的用量、促性腺激素的天數及HCG 日內膜厚度) 和胚胎發育情況(獲卵數、胚胎數、優胚數、移植胚胎的累積胚胎評分) 無差異的情況下，初步對比了妊娠組和未妊娠組胚胎培養液中VEGF的表達含量，結果表明，妊娠組胚胎培養液中VEGF的水平明顯低于非妊娠組，提示: 低水平的VEGF的優質胚胎具有高的種植能力。同時我們也發現具有更良好著床潛能的Ⅰ級胚胎對應的胚胎培養液中VEGF水平比胚胎質量稍差的Ⅱ級對應的卵胚胎培養液中VEGF水平明顯低，差異有統計意義。這些均提示胚胎培養液中的VEGF 水平可能比胚胎形態學更早更靈敏地預測胚胎移植后的臨床結局，可作為預測妊娠結局的一個參考指標。

3.3 卵泡液中VEGF的水平與胚胎質量的關系 盡管早年， Barroso等[9]研究發現，卵泡液中VEGF的含量與胚胎形態呈負相關，顯示卵泡液中高VEGF含量為胚胎發育不良的標志。Friedman等[10]的研究也發現患者卵泡液中VEGF的含量與獲卵數及妊娠率呈負相關。張四林等[11]通過測定卵泡液中VEGF濃度發現，優質胚胎(6細胞B級以上胚胎)組對應的卵泡液VEGF水平比非優質胚胎組水平低(P<0.05)。但是，有關胚胎培養液中VEGF水平在人的胚胎發育過程中的相關研究尚鮮有報道，培養液中VEGF的出現及水平對胚胎發育的具體作用機制還有待于進一步研究[12]。

多胎妊娠帶來的母嬰危害是有目共睹的，有數據顯示輔助生育技術多胎妊娠率升高明顯, 故輔助生殖領域都提倡單胚胎移植[13-15]。若胚胎培養液中VEGF的低濃度水平能表明胚胎的發育代謝能力，應用VEGF水平和胚胎形態學參數聯合選擇胚胎,將有可能得到發育潛能最優的胚胎用于移植，對于年輕者進行單胚胎移植，切實降低多胎妊娠的發生率，提高妊娠成功率。

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(本文編輯:黃攸生; 英文編輯:王建東)

Vascularendothelial growth factor level in embryo culture medium and its impact on clinical outcome of IVF-ET

REN Jian-zhi, CAI Jia-li, HAN Dong-mei,LIPing,GENGJie,MACai-hui,HANYan.

ReproductiveMedicineCenter, 174HospitalofPLA,Xiamen,Fujian361002,China

Objective To explore vascular endothelial growth factor (VEGF) level in embryo culture medium and the impact on early Embryo quality and clinic outcome in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET). Methods Embryo culture mediums were obtained on the third day. ELISA was used to detect the level of VEGF in embryo culture mediums. Results ①There were no significant difference in female age, the numbers of oocytes and embryos, the number of high-quality embryos, cumulative embryo score (CES) of embryo transfer in two groups (P>0.05).The level of VEGF in embryo culture medium in pregnancy group was significant lower than in no pregnancy group (P<0.05). ②The level of VEGF in embryo culture medium was statistically significant lower in gradeⅠ embryo than grade Ⅱ embryo (P<0.01). Conclusion The level of VEGF in embryo culture medium can be used as one of predictors of embryo quality and pregnancy outcome.

vascular endothelial growth factor (VEGF); embryo quality; modified long protocol

南京軍區醫學科技創新課題項目(10MB015)

361002福建廈門，解放軍174醫院生殖醫學中心

任建枝，蔡嘉力，韓冬梅，等.胚胎培養液中血管內皮生長因子的水平及其與IVF-ET結局的關系[J].東南國防醫藥，2016,18(5):472-474.

R711.6

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.05.007

2016-04-26;

2016-07-19)