AMHR2在人子宮內膜組織中的表達及相關研究

劉 磊，蘆小單，林秀英，孫牧男，付建華，譚 巖，方艷秋

(吉林省人民醫院 生殖醫學中心，吉林 長春130021)

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AMHR2在人子宮內膜組織中的表達及相關研究

劉 磊，蘆小單，林秀英，孫牧男，付建華，譚 巖，方艷秋*

(吉林省人民醫院 生殖醫學中心，吉林 長春130021)

目的 探討抗苗勒氏管激素Ⅱ型受體(AMHR2))在IVF-ET患者的子宮內膜組織著床窗口期的表達及意義。方法 采用免疫組織熒光染色檢測AMHR2在IVF-ET患者黃體期子宮內膜組織中的表達情況。分離培養原代子宮內膜間質細胞，用HCG處理細胞48 h，熒光定量PCR檢測HCG處理前后AMHR2基因表達情況；細胞化學染色檢測HCG處理前后AMHR2蛋白表達情況。結果 AMHR2在黃體中期人子宮內膜組織表達；HCG處理后子宮內膜細胞中AMHR2的基因和蛋白水平均顯著升高。結論 AMHR2在著床窗期子宮內膜間質細胞膜上表達，HCG可以增加其表達量，AMHR2可能作為預測子宮內膜容受性的參考指標。

抗苗勒氏管激素Ⅱ型受體；子宮內膜容受性；體外受精移植技術

(ChinJLabDiagn,2016,20:1856)

子宮內膜容受性缺陷占導致ART技術著床失敗原因的2/3，尋找子宮內膜容受窗期特異性表達的標志分子，診斷和治療子宮內膜容受性異常具有重要的現實意義[1-3]。抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)屬于TGF-β超家族成員，在卵泡發育的啟動和選擇性生長中發揮了重要作用，AMH的效應主要通過其Ⅱ型受體AMHR2發揮作用[4,5]。通過對VEGF調節雌性生殖器官中基因表達譜的生物信息學研究[6，7],我們發現AMHR2在子宮內膜組織中的表達水平與小鼠生殖能力的密切相關。本研究通過分析AMHR2在IVF周期患者子宮內膜中的表達的情況，探討AMHR2參與子宮內膜容受性的可能機制，為提高IVF妊娠率提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月-2015年1月吉林省人民醫院生殖醫學中心行IVF-ET助孕患者32例，納入標準：基礎內分泌正常；近3個月內未服用過任何激素類藥物及無宮腔操作史；B超檢測子宮內膜無異常回聲；輸卵管無積水；排除染色體異常及傳染病活動期等。

1.2 儀器和實驗材料 細胞培養箱(Thermo公司)；DMEM培養基、胰蛋白酶( Gibco 公司)、小牛血清(杭州四季青生物材料公司)；人重組VEGF (R&D公司)；總RNA 提取TRIZOL 試劑盒；逆轉錄反應和熒光定量PCR相關試劑(Promega公司)；7500 Fast型熒光定量PCR 儀(ABI公司)；兔抗人AMHR2單克隆抗體(Santa Cruz公司)；化學發光凝膠成像系統(中國Tanon公司)。

1.3 子宮內膜組織標本獲取 均于黃體期行預移植時采用一次性子宮內膜取樣器，進行子宮內膜機械刺激，留取子宮內膜組織標本。子宮內膜組織分成兩份，1份以4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后用于免疫熒光染色；1份用于原代培養分離間質細胞。

1.4 組織切片免疫熒光染色 石蠟切片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，烘片，二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，1M枸櫞酸液修復，0.3%TritonX-100透膜劑透膜，滴加封閉血清，一抗4℃孵育過夜，滴加熒光二抗室溫避光孵育2 h，滴加DAPI避光孵育2 min，含抗熒光淬滅劑的封片，并在熒光顯微鏡下立即觀察。

1.5 人子宮內膜上皮細胞的分離和培養 采用酶消化和離心法在體外分離、純化和培養原代人子宮內膜間質細胞，4%臺盼藍染色進行活細胞計數和觀察細胞活力；用免疫細胞化學方法鑒定hCG(100 ng/ml)處理細胞48 h前后子宮內膜間質細胞AMHR2表達情況。

1.6 熒光定量PCR測定基因表達水平 應用TRZOL試劑盒提取子宮內膜間質細胞總RNA，逆轉錄，熒光定量PCR反應。引物序列為AMHR2 forward:GATTTGAGGCCTGACAGCAG,reverse:GCCAGGTGGATGGGATGTAG;18 s forward:CATTCGAACGTCTGCCCTAT,reverse:GATGTGGTAGCCGTTTCTCA。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，循環30次；72℃終延伸10 min。根據2-△△CT方法計算基因表達水平差異。

1.7 統計學分析 數據統計和作圖采用GraphPad Prism5軟件，兩組間參數比較采用t檢驗，以P<0.05標記為差異性顯著。

2 結果

2.1 AMHR2在子宮內膜著床窗期的表達 AMHR2主要表達在子宮內膜間質細胞胞膜，部分表達于腺體上皮細胞膜表面，見圖1。

2.2 HCG對子宮內膜間質細胞的表達AMHR2的影響

分離培養原代子宮內膜間質細胞，用人促絨腺素HCG(100 ng/ml)處理細胞48 h，發現AMHR2基因表達水平顯著增加，免疫組化結果顯示AMHR2表達較對照組顯著增加，見圖2，圖3。

綠色熒光為AMHR2，藍色熒光為DAPI染色細胞核

圖1 AMHR2在人子宮內膜組織的表達×200

圖2 MHR2基因在體外培養的子宮內膜間質細胞的表達

圖3 細胞化學染色AMHR2表達體外培養的子宮內膜間質細胞的表達

3 討論

胚胎質量和子宮內膜容受性是影響IVF-ET技術妊娠率的關鍵因素。子宮內膜容受性的建立需要卵巢性激素、子宮內膜局部分子以及胚胎及其分泌的胚胎性因子等共同參與，篩選和驗證對子宮容受性有診斷和治療具有潛力的生物標記物具有重要的臨床應用價值[8-10]。

AMH-AMHR2信號通路在卵巢中參與卵泡發育的2個關鍵性步驟，一是抑制始基卵泡的起始募集，阻止其進入生長卵泡池；通過降低卵泡對FSH的敏感性抑制竇前卵泡和小竇狀卵泡的生長。AMH-AMHR2信號通路參與子宮內膜容受性的建立過程鮮有報道。

在應用新一代RNA測序技術對VEGF可逆抑制轉基因小鼠模型的研究中我們發現， VEGF對AMHR2等基因在子宮表達的差異狀況與小鼠生殖能力密切相關，AMH-AMHR2信號通路可能參與宮內膜容受性的建立過程。由此我們對進行IVF-ET助孕患者黃體中期子宮內膜AMHR2免疫組化結果分析發現，AMHR2主要分布在間質細胞和部分子宮內膜腺上皮細胞細胞膜。進一步通過對內膜間質細胞對HCG的反應性的結果分析發現，HCG具有顯著提高間質細胞AMHR2基因和蛋白的表達水平。HCG是一種早期胚胎滋養球細胞和胎盤滋養層合體細胞分泌的糖蛋白激素，在胚胎發育、早期妊娠黃體功能維持和胚胎種植與胎盤形成過程中發揮著不可缺少的生物學作用[11-13]。臨床應用研究發現，hCG宮腔灌注可以增加母-胎間血液供應、延遲子宮內膜蛻膜化進程和影響母-胎免疫過程提高輔助生殖技術臨床妊娠率[14,15]。由此，我們推測AMHR2是一種具有評估子宮內膜容受性的重要分子標志物，其參與子宮內膜容受性建立的機制還有待于進一步研究。

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The expression and correlation studies of Anti?Müllerian hormone receptor 2 in endometrium undergoing IVF

LIULei,LUXiao-dan,LINXiu-ying,etal.

(ReproductiveMedicalCenter,JilinProvincePeople'sHospital,Changchun130021,China)

Objective To investigate the expression and significance of AMHR2 in the endometrium during the implantation window period of the patients with IVF-ET.Methods The expression of AMHR2 in the endometrium of IVF-ET patients during the phase of corpus phase was detected by immunofluorescence staining.The endometrial stromal cells were isolated and cultured,and the cultured cells were treated by hCG for48h.The expression of AMHR2 was detected by method of PCR and Immunohistochemical analysis.Results The expression of AMHR2 were detected in endometrial implantation window,and the levels of AMHR2 gene and protein in endometrial cells were significantly increased after HCG treatment.Conclusion AMHR2 was detected in the endometrium during the implantation window of women,and level of AMHR2 were affected by HCG.AMHR2 might be a reference index to predict endometrial receptivity.

Anti-Mullerian hormone receptor 2，Endometrial receptivity，IVF-ET

吉林省科技廳項目(20160414021GH ，20150414023GH，20150520038JH)；吉林省衛計委項目(2013Q009)

1007-4287(2016)11-1856-03

R335.5

A

2016-01-14)

*通訊作者