VEGF siRNA和吉西他濱聯(lián)用對膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞株增殖和凋亡的影響

范海濤,楊 瀟,郭 航,張 明

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 泌尿外科,吉林 長春130041)

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VEGF siRNA和吉西他濱聯(lián)用對膀胱尿路上皮癌T24細(xì)胞株增殖和凋亡的影響

范海濤,楊 瀟,郭 航,張 明*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 泌尿外科,吉林 長春130041)

目的 探討VEGF si RNA聯(lián)合化療藥物吉西他濱(GEM)對人膀胱癌細(xì)胞株T24增殖和凋亡的作用。方法 用GEM處理VEGF siRNA表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法觀察細(xì)胞增殖率，吖啶橙染色和流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率，并對凋亡蛋白caspase-3的活性進(jìn)行對比分析。結(jié)果 VEGF siRNA和GEM單獨及聯(lián)合應(yīng)用均能不同程度的降低細(xì)胞增殖率，上調(diào)細(xì)胞凋亡率。FCM檢測數(shù)據(jù)顯示，VEGF siRNA和GEM單獨應(yīng)用的細(xì)胞凋亡率分別為5.1±1.3%和16.2±1.8%，與VEGF siRNA和GEM聯(lián)合應(yīng)用的35.4±2.7%相比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。兩者在誘導(dǎo)caspase-3活性方面也具有良好的協(xié)同增效作用。結(jié)論 VEGF siRNA和GEM對人膀胱癌細(xì)胞株T24的增殖和凋亡均有不同程度的影響，但兩者聯(lián)合應(yīng)用效果更好，這提示分子靶向用藥的基因治療與細(xì)胞毒藥物的化療聯(lián)合治療可能是提高療效、減少膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的主要途徑。

膀胱腫瘤；血管內(nèi)皮生長因子；RNA干擾；吉西他濱；細(xì)胞增殖；凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:1830)

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為活性強、特異性高的促血管生成因子對膀胱癌發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后的影響已被以往大量的研究所證實，而且在以其為靶點的膀胱癌抗血管生成治療中也取得了一定成績，但總體療效并不理想[1]。由于RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)有高效性，高特異性，高穩(wěn)定性和可遺傳性等特點，與其他抑制基因表達(dá)的技術(shù)相比具有明顯優(yōu)勢，目前已被廣泛采用[2]。近年來，腫瘤綜合治療模式日益受到人們的關(guān)注和重視，其中分子靶向用藥的基因療法與細(xì)胞毒藥物的化療聯(lián)合治療策略是迄今腫瘤治療研究的熱點之一[3，4]。本研究對VEGF siRNA+吉西他濱(gemcitabine，GEM)共用抑制膀胱尿路上皮癌(以下簡稱膀胱癌)細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行了初步探索，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料 人膀胱癌細(xì)胞株T24(中國科學(xué)院上海細(xì)胞所)，RPMI-1640培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)小牛血清(Hyclone公司)，PGC-siVE-GF質(zhì)粒和對照質(zhì)粒PGC-CONT(本實驗室構(gòu)建)，Caspase-3螢光分析試劑盒(clontech公司)，流式細(xì)胞儀(Coulter公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)，GEM(江蘇豪森藥業(yè))。

1.2 實驗方法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：PGC-siVEGF質(zhì)粒和對照質(zhì)粒PGC-CONT穩(wěn)定轉(zhuǎn)移的T24細(xì)胞(T24/PGC-siVEGF，T24/PGC-CONT)由本實驗室傳代保存。采用含10%小牛血清，青霉素100 u/ml和鏈霉素100 μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；②噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖率：將T24，T24/PGC-CONT、T24/PGC-siVEGF細(xì)胞以1×103細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)12 h后加入PBS或終濃度0.05 g/L的GEM，把細(xì)胞分為5組，即空白對照組、載體對照組、VEGF siRNA組、GEM組和聯(lián)合用藥組(VEGF siRNA+GEM)。細(xì)胞培養(yǎng)12、24、36、48 h后加入MTT，4 h后加入DMSO振蕩溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上檢測570 nm處的吸光度值(A)，計算各組細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率=實驗組平均A值/空白對照組平均A值×100%。實驗連續(xù)重復(fù)3次；③吖啶橙染色和流式細(xì)胞儀(FCM)分別檢測細(xì)胞凋亡率：用0.1%的吖啶橙加入用胰酶消化后的懸液T24細(xì)胞，涂片，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及顏色。凋亡細(xì)胞變圓，核/漿比例增大，胞漿顆粒增多，胞核皺縮變形，大小不均，早期凋亡細(xì)胞核呈圓縮狀的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞核呈枯縮狀的桔黃色熒光。凋亡細(xì)胞計數(shù)，計算凋亡率。實驗連續(xù)重復(fù)3次。將T24細(xì)胞或轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞分別接種于6孔板。各自加入PBS或GEM處理48 h后收集，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌后逐滴緩慢加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇中4℃固定24 h，PBS洗滌去除固定液，加入RNaseA和碘化丙啶染液(PI)重懸細(xì)胞，避光染色2 h時用FCM檢測，MultiCycler軟件分析結(jié)果；④ 檢測凋亡蛋白caspase-3活性：在加入GEM后2、4、6、8、12、24 h后分別收集細(xì)胞，每組6個樣本數(shù),每個樣本所用的T24細(xì)胞濃度均為1×106.用熒光分光光度計檢測熒光底物AFC的強度，以此確定caspase-3活性。按照clontech公司caspase-3熒光分析試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測，結(jié)果繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出caspase-3活性。

2 結(jié)果

2.1 對T24細(xì)胞增殖的影響 MTT比色法檢測各組細(xì)胞在12、24、36、48 h的增殖率，結(jié)果表明VEGF siRNA和GEM單獨處理的細(xì)胞增殖率從24 h開始明顯低于對照組(P<0.05),而聯(lián)合用藥(VEGF siRNA+GEM)組細(xì)胞增殖率在12 h時即明顯低于對照組(P<0.05)，載體和空白對照兩組的細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。如圖1所示。

圖1 細(xì)胞增殖曲線；※P<0.05，※※P<0.01vs

2.2 對T24細(xì)胞凋亡的作用 吖啶橙染色結(jié)果顯示：VEGF siRNA組，GEM組和VEGF siRNA+GEM組的細(xì)胞凋亡率依次為6.4%、19.2%和38.1%；FCM檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果的數(shù)據(jù)分別為VEGF siRNA組5.1±1.3%，GEM組16.2±1.8%，VEGF siRNA+ GEM組35.4±2.7%。兩種檢測結(jié)果均指出，單獨用藥或聯(lián)合治療均能不同程度的誘導(dǎo)與促進(jìn)T24細(xì)胞凋亡，但聯(lián)合用藥作用更大，效果更好。組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與載體組和空白對照組相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。如圖2和圖3所示。

2．3 對caspase-3活性的影響 在VEGF siRNA和GEM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中，caspase-3活性上調(diào)均具有時效相關(guān)性，但變化趨勢不同。隨時間延長VEGF siRNA組caspase-3活性升高，GEM組在作用4 h后caspase-3活性達(dá)最高峰，隨后逐漸下降，但始終高于載體對照組。VEGF siRNA+GEM組在1 h和2 h時與GEM組比較：caspase-3活性無明顯差異，但自4 h始，其活性一直高于GEM組(P<0.05)。caspase-3活性變化順次為：VEGF siRNA+GEM組>GEM組>VEGF siRNA組>載體對照組，組間比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。如表1所示。

圖2 吖啶橙染色檢測細(xì)胞凋亡率(X400)

圖3 FCM檢測細(xì)胞凋亡率

組別時間(h)12481624載體對照242.5±6.5241.3±8.6242.3±10.5243.1±8.9241.4±9.0242.8±7.9VEGFsiRNA248.5±11.6254.7±9.8287.2±13.6320.5±10.8*395.3±8.6*428.7±12.8*GEM319.8±11.5*407.6±17.3*729.6±12.1*458.3±15.5*422.7±9.4*396.2±10.8*聯(lián)合用藥403.7±12.2*483.3±16.6*785.3±20.5*△693.1±18.2*△675.2±17.3*△671.8±13.5*△

*與載體對照組比較，P<0.05；△與GEM組相比，P<0.05

3 討論

臨床資料統(tǒng)計結(jié)果表明，無論是以VEGF為靶點的抗血管生成的基因療法還是針對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒藥物的化療，在惡性腫瘤的治療中，特別是在預(yù)防腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的后續(xù)治療過程中均取得了一定成績和獲得了不同程度的療效。但是，根據(jù)近年來的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，由于單純基因治療和單純化療的總體有效率仍較低，并且腫瘤臨床緩解時間及患者術(shù)后生存時間較短[5,6]。因此，研究人員普遍認(rèn)為只有探索更為高效和更為合理地聯(lián)合治療方案，才能提高療效從而更好地改善惡性腫瘤患者的生活質(zhì)量并延長其生存時間。目前廣受青睞的分子靶向治療與化療藥物聯(lián)用似有著巨大潛力和良好前景。

本實驗通過VEGF siRNA沉默VEGF和通過GEM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用達(dá)到了較好抑制腫瘤血管生成和遏制腫瘤生長的效果。在將兩種不同性質(zhì)的藥物聯(lián)合應(yīng)用時，其療效大大提高，這是我們初步認(rèn)為，以RNA干擾為基礎(chǔ)的基因治療與化療聯(lián)用可能是膀胱癌治療尤其是提高術(shù)后療效的新的有效手段之一。

另外，鑒于caspase-3屬細(xì)胞凋亡效應(yīng)因子，其在激活形成凋亡信號傳導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)和介導(dǎo)凋亡的過程中起著非常重要的作用[7]。由于細(xì)胞凋亡與腫瘤的生長轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，故實驗同時對caspase-3的活性進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果證實，VEGF siRNA和GEM均能不同程度的上調(diào)caspase-3活性。VEGF siRNA的這種作用很可能是通過降低凋亡抑制因子survivin表達(dá)來實現(xiàn)的[8]。而GEM是一種破壞細(xì)胞復(fù)制的二氟核苷素抗代謝物抗癌藥，本身即有通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長的作用。這可能也是VEGF siRNA+GEM組作用最大、效果最好的根本原因。

本實驗數(shù)據(jù)結(jié)果初步顯示，靶向VEGF的RNAi和化療藥物GEM聯(lián)用具有1+1>2的療效，有望為臨床膀胱癌的治療水平帶來新的提高。

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Influence of proliferation and apoptosis of bladder cancer cell line T24 by VEGF siRNA combining with gemcitabine

FANHai-tao，YANGXiao，GUOHang，etal.

(DepartmentofUrology,theSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

Objective To study the role of VEGF siRNA combining with gemcitabine (GEM) in inducing the apoptosis of human bladder cancer cell line T24.Methods process T24 cell that transfected stably by VEGF siRNA expressed plasmid.Using MTT assay observing the survival of cell,using acridine orange staining and flow cytometry (FCM) detecting the apoptosis rate of cells,and analyze the activity apoptotic protein caspase-3.Results VEGF siRNA and GEM alone or in combination can both can induce the survival of cell and increase the apoptosis rate of cell in varying degrees.The FCM detecting date indicates,the apoptosis rate of cells by using VEGF siRNA or GEM alone is 5.1 ± 1.3% and 16.2 ± 1.8%,compared with the apoptosis rate by using VEGF siRNA and GEM in combination is 35.4±2.7%,the difference had statistical significance(P<0.01).Both has a good synergy in the induction of caspase-3 activity.Conclusion VEGF siRNA and GEM has promoting roles in the apoptosis of human bladder cancer cell line T24 in varying degrees but it has a better effect when they combine with each other.This suggests the combined therapy of gene therapy of molecularly targeted therapy and chemotherapy of drug cytotoxic drugs may be the main pathway to improve the efficacy and reduce the risk of recurrence of bladder cancer after surgery.

Bladder tumor;Vascular endothelial growth factor;RNA interference;Gemcitabine;Cell proliferation;apoptosis

吉林省自然科學(xué)基金項目(編號：20150101195JC)

1007-4287(2016)11-1830-04

R737.14

A

范海濤，醫(yī)學(xué)博士，副教授，研究方向：泌尿系腫瘤的治療與預(yù)防.

2015-08-11)

*通訊作者