不同效靶比CIK對小細胞肺癌殺傷效應的實驗研究

趙 鑫，常 穎，劉玉俠，趙 暉，盧衛平，于 鴻，王 斌*

(1.吉林省腫瘤醫院，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012)

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*通訊作者

不同效靶比CIK對小細胞肺癌殺傷效應的實驗研究

趙 鑫1，常 穎1，劉玉俠2，趙 暉1，盧衛平1，于 鴻2，王 斌1*

(1.吉林省腫瘤醫院，吉林 長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長春130012)

目的 探討細胞因子殺傷細胞(cytokine induced killer cells，CIK)與小細胞肺癌細胞NCIH-446在不同效靶比的情況下對NCIH-446的殺傷效果，為臨床合理應用CIK治療腫瘤提供科學的數據。方法 體外培養CIK細胞并鑒定，與NCIH-446細胞在50∶1,25∶1,12.5∶1的比例下進行共同培養，用xCELLigence RTCA S16實時無標記細胞功能分析儀對兩者的作用進行實時監測，共監測48 h。結果 CIK與NCIH-446在50∶1,25∶1,12.5∶1時，隨著時間的延長，CIK對NCI446的殺傷作用也逐漸提高，從2 h的74.18%，67.98%，46.76%到48 h的95.00%，96.95%，93.82%。但在同一時間段3種不同比例的殺傷活性，2 h和6 h有差異(P<0.01)，13 h后同時間段的殺傷活性沒有明顯差異，但殺傷效果均明顯提高。結論 CIK與NCIH-446在效靶比為50∶1、25∶1、12.5∶1時細胞的殺傷性在2 h，6 h時存在數量依賴關系，細胞數越高，殺傷活性越強。但隨著時間的延長，這種依賴關系不明顯，各種比例的細胞殺傷作用均不斷增強。

CIK細胞；小細胞肺癌細胞；殺傷活性

(ChinJLabDiagn,2016,20:1808)

生物治療在惡性腫瘤的治療中日益受到重視，被譽為腫瘤治療的第四大療法。由于它具有明確的殺傷腫瘤及提高免疫力的效果，并且沒有明顯的副作用，對于不能手術及放化療以及手術及放化療后的患者是很好的治療選擇。生物治療的細胞腫瘤很多，本實驗選擇CIK進行實驗研究，監測其對小細胞肺癌細胞NCIH-446的殺傷作用，為CIK用于小細胞肺癌的治療提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 IMDM培養基 購于GIBCO公司；IL-1α購于Peprotech公司;胎牛血清：購于天津康源公司；淋巴細胞分離液：購于天津灝洋生物制品科技責任有限公司；IL-2：購于北京四環生物制藥有限公司；anti-CD3Ab:Biolegend公司。anti-hunman CD3-FITC,anti-hunman CD16、CD56-PE,購自 BD公司；IFN-γ：購于天津灝洋生物制品科技責任有限公司；CD3+、CD4+、NK 、NKT 、CD3+HLA-DR+ 、CD8+CD28+熒光標記單克隆抗體：購自美國BECKMAN COULTER公司。小細胞肺癌細胞株NCIH-446：吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.1.2 實驗設備 實時無標記細胞功能分析儀XCELLigence RTCA S16，E-Plate16細胞檢測板:北京昊諾斯科技有限公司提供；低溫高速離心機，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養箱，Thermo Scientific公司；流式細胞儀，BD公司。

1.2 方法

培養NCIH-446細胞：將凍存的NCI446細胞復蘇、培養至對數生長期，用0.25%胰酶進行消化后，計數為6×104/ml,待用。首先向E-Plate16細胞檢測板中每孔加入50 μl含10%胎牛血清的IMDM培養液在370C，5%CO2培養箱測量基線，然后取出E-Plate16板，在超凈工作臺內接種100 μl/孔已調好細胞數的NCIH-446。放入xCELLigence RTCA S16實時無標記細胞功能分析儀中，再放回到37℃，5%CO2培養箱進行培養，24 h后加入不同濃度的效應細胞(CIK)，開始進行實時監測CIK細胞對NCIH-446的殺傷效應。設定指標48 h，15 min測定1次。 效應細胞CIK的制備及鑒定，見參考文獻[1]。將培養10天的CIK調細胞數為3×106/ml,按以下設計加到已接種靶細胞NCIH-446的E-Plate16細胞檢測板中，每孔100 μl，放入37℃。5%CO2培養箱中培養。分4組，第1組:NCIH-446；第2組:CIK1+NCIH-446(50∶1)；第3組;CIK2+NCIH-446(25∶1)；第4組：CIK3+NCIH-446(12.5∶1)。

1.3 統計學分析

應用SPSS17.0進行統計學分析，實驗數據以平均值成對二樣本進行T檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

xCELLigence RTCA S16實時無標記細胞功能分析儀監測的CIK在不同時間，不同比例對NCIH-446的殺傷效果。圖中紅線為NCIH-446，粉線為CIK+NCIH-446(50∶1)，藍線為CIK+NCIH-446(25∶1)，綠線為CIK+NCIH-446(12.5∶1)。 見圖1，圖2。圖1顯示CIK對NCIH-446的殺傷作用在共同培養2個 h左右就顯現出來，而且隨著時間的推移，殺傷效果不斷增強。圖2為CIK與NCIH-446在不同比例，不同時間殺傷效果圖。其中在2 h和6 h時12.5∶1的殺傷效果要低于50∶1和25∶1，統計學有差異(P<0.01)，而13 h以后，各比例的殺傷效果在同一時間點統計學上沒有明顯差異(P>0.05)，但總體殺傷效果是隨著時間的推移逐漸提高，在48 h均達到了90%以上。

3 討論

小細胞肺癌的治療根據發病時間及確診時的病情發展情況等，可以選擇手術、化療、放療等治療方法，但由于其惡性程度高，侵襲性強，細胞倍增時間短[2]，對于常規方法治療后的病人，容易發生早期轉移和復發[3]。生物治療是目前腫瘤治療的一種新的手段，它可以直接殺傷腫瘤細胞，激活免疫系統，提高免疫力，因此，對手術、化療、放療后免疫功能的恢復，對微小轉移病灶的清除都將發揮一定作用[4]。

生物治療細胞的種類很多，包括樹突狀細胞(DC)、細胞因子活化的殺傷細胞(CIK)、自然殺傷細胞(NK)、T細胞，γδT細胞等。本實驗選取了其中的CIK(cytokine-induced killer)細胞作為效應細胞，探討其對小細胞肺癌的體外殺傷作用，為其臨床應用提供數據。

圖1 CIK對NCIH-446的殺傷作用

圖2 CIK與NCIH-446在不同比例，不同時間殺傷效果(與12.5∶1相比，*P<0.01)

體外培養的CIK細胞可以表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，所以又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，因此具有T淋巴細胞強大的殺傷活性和NK細胞無MHC限制性的優點，使其應用更加廣泛[5]。本實驗通過不同細胞數量的CIK與小細胞肺癌NCIH-446共同培養，檢測不同效靶比以及培養不同時間的CIK對NCIH-446的殺傷作用，為臨床合理應用CIK細胞提供實驗數據。

本實驗用xCELLigence RTCA S16實時無標記細胞功能分析儀監測CIK與NCIH-446在50∶1,25∶1,12.5∶1的不同比例下對NCIH-446的殺傷作用。本實驗對殺傷作用共進行了48 h的實時監測，從監測結果可以看出，3種效靶比的CIK細胞在互相作用的2個 h開始就起作用，而且隨著時間的延長，殺傷作用不斷增強，從2 h的74.18%，67.98,46.76到48 h分別達到95%，96.95%，93.82%，從實驗結果來看，CIK細胞對NCIH-446有較強的殺傷作用，而且這種作用會隨著時間的推移不斷增強，這也提示如果給病人應用CIK細胞進行治療，由于體內的環境要好于體外環境，CIK細胞會不斷增殖，殺傷效果及持續時間可能會更好。由于本實驗只做了48 h的監測，只能證明在48 h內的殺傷作用是隨著時間的延長，殺傷效果越好。本實驗的結果為小細胞肺癌的臨床治療時細胞數量的選擇提供了數據，為小細胞肺癌的治療提供了除了手術、化療、放療外的一種新方法。

[1]趙 鑫，常 穎，劉玉俠，等.培養不同時間CIK細胞免疫表型變化與其抗腫瘤活性關系的研究[J].中國實驗診斷學，2015,19(9)：1455.

[2]廖美琳，王慧敏.小細胞肺癌的治療進展[J].腫瘤，2001,21(6)：399.

[3]劉 迪，樊 旼.小細胞肺癌分子遺傳學研究進展[J].中國癌癥雜志，2014,24(8)：630．

[4]劉清池，張慧敏，張玉娜，等.DC-CIK細胞清除微小殘留白血病的臨床研究[J].中國腫瘤生物治療雜志，2013,20(4)：398.

[5]Hontscha,Borck Y,Zhou H,et al.Clinical trials on CIK cells:First report of the international registry on CIK cells(IRCC)[J].J cancer Res Clin Oncol,2011,137(2):305.

The experimental study of CIK killing effect on small cell lung cancer in different effector target ratio

ZHAOXin,CHANGYing,LIUYu-xia,etal.

(JilinProvinceTumorHospital,Changchun130012,China)

Objective Investigate the killing effect which Cytokines killer cells(cytokine induced killer cells,CIK)have on small cell lung cancer cell NCIH-446 in different effector target ratio and provide scientific data for reasonable clinical application of CIK in cancer treatment.Methods Culture CIK cells in vitro and make the identifition,then co-culture CIK cells with NCIH-446 cells in 50∶1,25∶1,12.5∶1 proporation,monitor their effect with xCELLigence RTCA S16 unmarked cell function analyzer in real-time for 48 hours.Results When CIK and NCIH-446 are in 50∶1,25∶1,12.5∶1 proporation,the killing effect CIK has on NCI446 improves from 74.18%,67.98%,46.76% in the 2 hour to 95.00%,96.95%,93.82%in the 48 hour with the extension of time.at the same time,the killing activity in 3 different proporations differs between the 2 hour and the 6 hour(P<0.01),13 hours later,the killing activity has no significant differences but the killing effect improves obviously.95.00%,96.95%,93.82%in the 48 hour with the extension of time.at the same time,the killing activity in 3 different proporations differs between the 2 hour and the 6 hour(P<0.01),13 hours later,the killing activity has no significant differences but the killing effect improves obviously.Conclusion When CIK and NCIH-446 are in 50∶1,25∶1,12.5∶1 effector target ratio,the killing effect of cells has the number of dependencies in the 2nd and 6th hour,the higher cell number,the higher killing activity but with the extension of time,the dependency is not obvious and the killing effect of cells in different proporation is increasing.

CIK cells;small cell lung cancer cell;killing activity

1007-4287(2016)11-1808-03

R734.2

A

2016-04-14)