異種去細胞肌腱的制備及其生物相容性的實驗研究

李軍　徐寶成　王茂榮　伍盛為

【摘要】 目的 分析異種去細胞肌腱的制備及其生物相容性的實驗研究。方法 選取3只健康家豬， 并進行選擇性的去細胞異種皮， 同時選取成年Wistar大鼠70只與成年SD大鼠5只， 進行選擇性的去細胞異種皮， 并在術后進行組織學觀察。結果 對選擇性去細胞異種皮與組織學進行觀察后得知， 大體觀察表現為表皮層較為連續完整， 其表皮面與真皮面分別為黃白色與瓷白色， 較為柔軟；進行皮下植入實驗后得知， 對其進行大體觀察后顯示實驗動物手術順利完成， 術后活動良好， 手術切口無腫脹、滲液滲出等情況。結論 采取戊二醛-胰蛋白酶-去污劑制備選擇性去細胞異種皮具有良好的生物相容性與形態學優勢， 可有效修復大面積深度燒傷的創面， 臨床意義顯著。

【關鍵詞】 生物相容性；異種去細胞肌腱；制備；實驗

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.28.195

對于大面積深度燒傷的患者來說， 其自體皮源十分匱乏， 目前臨床上較為有效的一類治療方案為自體微粒皮移植手術[1]。其中選擇性去細胞異種皮可幫助患者誘導細胞生長分化， 并有效保護創面， 將該項技術用于修復深度燒傷創面患者的臨床意義顯著。本次研究采取動物實驗方案， 并取得了十分顯著的應用效果， 具體報告如下。

1 材料與方法

1. 1 動物與主要試劑 選取3只健康白色家豬， 平均體重（76±8）kg， 成年Wistar大鼠70只， 平均體重（252±14）g， 成年SD大鼠5只， 平均體重（258±12）g， 主要試劑包括25%的戊二醛、胰蛋白酶、小鼠成纖維細胞等。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 將家豬處死后去毛， 并將大張全厚皮剝離后去除脂肪， 將戊二醛稀釋至0.1%， 對表皮面連續固定60 min， 反復沖洗后削為0.4～0.8 mm厚的斷層皮片， 并采用新潔爾滅連續浸泡15 min， 采用生理鹽水反復進行清洗， 給予0.25%的胰蛋白酶消化30 min（37℃）， 并置入TritonX-100溶液內持續進行震蕩24 h， 將其反復進行沖洗后置入冰箱內（4℃）保存， 并將包含慶大霉素的生理鹽水連續浸泡24 h， 并且每隔6 h換取1次液體， 將其進行封裝、輻照消毒并保存。對表皮的保留情況、皮片顏色、質地等進行嚴密觀察， 將選擇性去細胞異種皮置于甲醛溶液內（4%）進行固定， 并用石蠟進行包埋、切片、HE染色處理等， 對表皮結構、纖維變化情況等進行嚴密觀察， 同時將新鮮的豬皮進行對照觀察。

1. 2. 2 5只成年SD大老鼠， 在手術前24 h對背部進行備皮處理， 將氯胺酮與速眠新進行混合后對腹腔進行注射麻醉處理， 并在大鼠的背部切取全層皮膚， 將其置于生理鹽水內備用。70只成年Wistar大鼠， 依據背部皮下植入材料的不同分為1組、2組、3組， 其中1組選擇性去細胞異種皮， 2組植入新鮮的豬皮， 3組植入大鼠的異體皮， 并在術前的24 h選擇背部備皮， 將全層的皮膚切開， 將皮下組織進行分離后制備皮下囊， 并植入皮片內對切口進行縫合處理， 手術完成后的1、2、4、8、12、16周將大鼠的皮膚切開進行觀察， 觀察大鼠的皮片與周圍組織的粘連情況， 并進行HE染色處理， 對移植區域的炎性反應程度與新生血管、纖維基質細胞長入情況進行觀察分析。

對其進行炎性反應分級， 分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級。其中Ⅰ級表示試樣的周圍無淋巴細胞或者極少量的淋巴細胞；Ⅱ級表示表示出現少量的淋巴細胞；Ⅲ級表示出現少量的中性粒細胞、巨細胞反應、淋巴細胞浸潤等；Ⅳ級表示試樣周圍伴有以中性粒細胞浸潤為主的炎性反應。

2 結果

2. 1 對選擇性去細胞異種皮與組織學進行觀察后得知， 大體觀察表現為表皮層較為連續完整， 其表皮面與真皮面分別為黃白色與瓷白色， 較為柔軟。

2. 2 進行皮下植入實驗后得知， 對其進行大體觀察后顯示實驗動物手術順利完成， 術后活動良好， 手術切口無腫脹、滲液滲出等情況。

3 討論

進行微粒皮移植時， 需要采取暫時性的覆蓋物進行保護， 較為常見的覆蓋物包括新鮮豬皮與異體皮， 其中異體皮可以使得大面積燒傷的治愈率得到明顯的提高， 臨床應用價值顯著， 但是關于異體皮的來源受限較多， 且對于傳播病變的微生物可能性難以進行徹底的消除， 所以說， 其臨床應用受限[2]。而新鮮的豬皮具有價格經濟、來源廣泛等特點， 但是發生移植后將出現較早時間的排斥反應， 并且當創面愈合后優于真皮取法將使得功能于外觀均不佳。因此， 針對上述問題， 本次研究提出選擇性去細胞異種皮的概念， 并將其與自體微粒皮進行有效結合， 將其覆蓋深度的燒傷創面將得到較為顯著的應用效果。

本次研究選擇戊二醛-胰蛋白酶-去污劑進行進行選擇性去細胞異種皮實驗， 相比以往的臨床研究得知， 其中戊二醛的濃度有所下降， 同時胰蛋白酶的作用時間縮短， 將戊二醛作用于表皮面可以助于滲入表皮層， 并產生氨基酸殘基反應， 使得膠原分子能夠與氨基酸側鏈產生交聯作用， 將抗原部位進行有效遮蔽， 使得膠原分子之間的穩定性與張力有所提高。其中胰蛋白酶抗原溶解部分真皮層的基質， 使得細胞間隙較為疏松， 并幫助破壞細胞的完整性， 使得胰蛋白酶作用時間縮短， 利于將表皮結構完整進行保留。而非離子型表面活性劑可以與細胞膜磷脂進行結合， 并達到去污、脫細胞的效果[3， 4]。

本次研究結果顯示， 對選擇性去細胞異種皮大體觀察表現為表皮層較為連續完整， 其表皮面與真皮面分別為黃白色與瓷白色， 較為柔軟；進行皮下植入實驗后得知， 實驗動物手術順利完成， 術后活動良好， 手術切口無腫脹、滲液滲出等情況。

綜上所述， 采取戊二醛-胰蛋白酶-去污劑制備選擇性去細胞異種皮具有良好的生物相容性與形態學優勢。

參考文獻

[1] 聶繼平， 溫樹正， 白志剛， 等. 去細胞異種肌腱復合IGF-Ⅰ修復肌腱缺損的實驗研究. 中華臨床醫師雜志（電子版）， 2013， 7（17）：95-99.

[2] 王卉麗. 間充質干細胞（MSC）親和肽綁定膠原支架促進豬急性全層創面愈合的研究. 南京大學， 2014.

[3] 陳元良. 異種脫細胞肌腱鼻充填材料的生物相容性研究. 南方醫科大學， 2012.

[4] 武龍. 小腸黏膜下層細胞外基質水凝膠的制備及其對肝組織損傷修復的影響. 蘇州大學， 2015.

[收稿日期：2016-09-21]