小細胞肺癌患者血漿循環DNA定量檢測和完整性分析

朱建凱，朱海燕，龍文娟

(青島市精神衛生中心檢驗科，山東青島 266034)

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·臨床研究·

小細胞肺癌患者血漿循環DNA定量檢測和完整性分析

朱建凱，朱海燕，龍文娟

(青島市精神衛生中心檢驗科，山東青島 266034)

目的 定量檢測小細胞肺癌患者血漿循環DNA并進行完整性分析。方法 收集60例肺癌患者(病例組)、40例健康者(對照組)樣本，采用實時熒光定量PCR，以管家基因GAPDH為目的基因定量檢測血漿DNA水平；以肌動蛋白基因β-actin為目的基因(長片段543bp，短片度230bp)分析完整性。應用SPSS19.0統計統計進行數據分析。結果 病例組患者血漿DNA水平[(3.105×105±0.923×105)copies/μL]高于對照組[(1.522×105±3.241×104)copies/μL]。病例組患者血漿DNA完整度指數(0.208 2±0.132 8)明顯高于對照組(0.077 96±0.038 6)，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論 小細胞肺癌患者血漿循環DNA水平和完整度均高于健康者。

癌,小細胞; 肺腫瘤；DNA/血液; 血液循環；DNA完整性

小細胞肺癌(SCLC)約占肺癌的20%，惡性程度高，轉移早而廣泛。目前用于檢測和診斷SCLC的常見方法有影像學和腫瘤標志物如血清神經元特異烯醇化酶(NSE)、胃泌素釋放肽前體(Pro-GRP)、細胞角質蛋白19片段抗原(CYFRA21-1)、癌胚抗原(CEA)和癌抗原242(CA242)等。循環DNA是存在于血漿等體液中的游離DNA，SCLC患者腫瘤組織可通過細胞壞死、凋亡等方式釋放出，其水平與腫瘤進展、治療及預后密切相關[1]。循環DNA的完整性為長片段與短片段DNA的比值[2]。本研究對SCLC患者循環DNA水平進行了檢測，計算其完整度，旨在探討循環DNA的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 60例肺癌患者(病例組)中男42例，女18例；年齡33～79歲，中位年齡58歲。另選擇41例健康者作為對照組。所有血液標本均使用乙二胺四乙酸二鉀真空采血管收集，取自患者術前。采血后3 500 r/min離心10 min分離血漿，取上清液，獲得無血細胞成分的血漿，用1.5 mL離心管分裝。

1.2 DNA抽提及檢測[3]DNA抽提使用QIAamp DNABlood Mini Kit(Qiagen)試劑盒。循環DNA水平檢測使用實時熒光定量PCR，以管家基因GAPDH為目的基因(表1)，引物序列參照相關文獻設計。DNA樣本與SYBR Green I 熒光染料以1∶100混合，使用ABI7500實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)定量檢測，根據各自設定的臨界值的循環數(Ct)值，計算循環DNA原始拷貝數，進一步分析實驗室和對照組標本DNA水平。

1.3 DNA完整性分析 參照文獻[4]，選用肌動蛋白基因β-actin為目的基因。設計引物擴增長片段543 bp，短片度230 bp。所有引物由上海生工生物工程公司合成。采用普通PCR儀擴增目的基因，反應條件：95 ℃預變性4 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。完整度計算為長片段與短片段PCR擴增產物比值。瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒DR01購自北京艾德萊生物科技有限公司。

2 結 果

2.1 實時熒光定量PCR標本DNA純度以A260/280值判斷，病例組和對照組分別為1.81、1.85，可滿足實驗需要。擴增曲線和溶解曲線提示熒光定量PCR的實驗條件良好。

表1 目的基因及引物序列

2.2 兩組研究對象血漿循環DNA水平比較 病例組患者血漿DNA水平[(3.105×105±0.923×105)copies/μL]高于對照組水平[(1.522×105±3.241×104)copies/μL]，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 循環DNA完整度分析 以肌動蛋白基因β-actin為模板，病例組患者血漿DNA完整度指數(0.208 2±0.132 8)明顯高于對照組(0.077 96±0.038 6)，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討 論

循環DNA來源于細胞凋亡(正常人群，長度185～200bp)和細胞壞死(腫瘤患者，以長鏈DNA片段為主)[3，5-6]。肺癌在演化的不同階段會伴隨特定基因的改變，這些改變了的DNA片段會進入血循環中。有研究發現，血漿中游離DNA具有一定的腫瘤源性，因為其基因改變與腫瘤中的基因改變具有一致性。由于腫瘤患者細胞壞死所釋放的游離DNA以長片段為主，其完整度高于健康者[7]。本研究60例小細胞肺癌患者血漿循環DNA水平和完整度均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.01)，與已有研究結論一致[8]。由于血漿循環DNA水平很低，本研究進一步證實實時熒光定量PCR方法在靈敏度、重復性和準確度方面均能滿足臨床需要[9]。

值得注意的是，檢測標本采用血漿而不是血清主要原因是血液凝固時白細胞破裂，釋放DNA，不能完全反應循環DNA的真實水平。此外系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎[10]和白血病[4]、食管癌[11]等疾病時也會釋放長片段DNA，因此，血漿游離DNA完整性對SCLC診斷的特異性不高。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.054

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1673-4130(2016)02-0262-02

2015-08-31