實時熒光定量PCR在疑似肺外結核診斷中的應用價值

張 瑞

(延安大學附屬醫院，陜西延安 716000)

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·臨床研究·

實時熒光定量PCR在疑似肺外結核診斷中的應用價值

張 瑞

(延安大學附屬醫院，陜西延安 716000)

目的 探討實時熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測在疑似肺外結核診斷中的價值。方法 將懷疑有結核分枝桿菌感染的患者101例分為關節炎組(17例)、胸腹膜炎組(32例)、淺表淋巴結核組(20例)、腎結核組(13例)、其他結核組(19例)，分別取關節腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液、尿液等標本采用實時FQ-PCR進行結核分枝桿菌DNA(TB-DNA)檢測，同時進行抗酸桿菌涂片檢測，對檢測結果進行比較和統計分析。結果 101例疑似肺外結核患者關節穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液、尿液、腦脊液等TB-DNA檢測陽性率分別為41.18%、37.50%、50.00%、46.15%、35.87%；抗酸桿菌涂片檢測陽性率分別為11.76%、9.38%、10.00%、7.69%、5.26%。抗酸桿菌涂片檢測陰性標本采用實時FQ-PCR檢測陽性率為35.87%，抗酸桿菌涂片檢測陽性標本采用實時FQ-PCR檢測全部為陽性。結論 實時FQ-PCRR在疑似肺外結核診斷中具有重要價值。

聚合酶鏈反應； 熒光光度測定法； 肺外結核； 診斷價值

我國人口眾多，肺結核患者人數巨大[1]。與此同時肺外結核發病率也呈逐年上升趨勢，結核性胸膜炎、結核性腦膜炎、結核性關節炎、淋巴結核、腎結核患者數量增多。肺外結核由于較為隱匿而較難發現，因此，臨床診斷難度較大，一直以來均是困擾臨床醫生的問題，傳統方法檢出率低，檢測周期過長導致臨床漏診時有發生，嚴重影響患者預后[2]。近年來隨著實時熒光定量PCR(FQ-PCR)技術的應用，肺外結核檢出率較以前有了較大提高[3]。本研究對住院的101例肺外結核患者TB-DNA檢驗結果和抗酸桿菌涂片檢測結果進行了分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012～2014在本院住院的疑似肺外結核患者101例，其中男67例，女34例；年齡11～84歲，中位年數49歲。分為關節炎組(17例)、胸腹膜炎組(32例)、淺表淋巴結核組(20例)、腎結核組(13例)、其他結核組(19例)。

1.2 標本來源 臨床醫生在無菌條件下分別抽取關節腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液及留取中段尿液5 mL并將標本置于無菌瓶中立即送檢。

1.3 試劑 抗酸桿菌涂片檢測染色液為珠海貝索生物技術有限公司提供，結核分枝桿菌DNA檢測試劑、質控品、標液均為中山大學達安基因公司提供。

1.4 檢測方法 對采集的標本分別采用實時FQ-PCR檢測TB-DNA和抗酸桿菌涂片檢測抗酸桿菌。

1.4.1 實時FQ-PCR 分別取無菌留取的穿刺液和尿液各1 mL，加入1.5 mL離心管中12 000 r/min離心5 min，留取沉淀，加入1 mL無菌生理鹽水洗滌2次，離心留取沉淀并加入50 μL DNA提取液充分混勻，在100 ℃恒溫干浴10 min后冷卻并12 000 r/min離心5 min待用。陰、陽性質控品按操作規程進行處理。將處理過的標本，標準品，陰、陽性質控品分別吸取上清液腦脊液、2 μL加入反應管中，瞬時離心5 s，按預設程序進行擴增和分析。

1.4.2 抗酸桿菌涂片 分別取無菌留取的穿刺液和尿液各1 mL，3 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉渣涂片，固定，抗酸染色，鏡檢。

1.5 統計學處理 應用SPASS13.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組患者抗酸桿菌涂片和實時FQ-PCR檢測結果比較 各組抗酸桿菌涂片檢測陽性率均明顯低于實時FQ-PCR，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 各組患者抗酸桿菌涂片和實時FQ-PCR檢測結果比較

*：P<0.05，與同組抗酸桿菌涂片比較。

表2 抗酸桿菌涂片與實時FQ-PCR陽性率比較

*：P<0.01，與抗酸桿菌涂片比較。

2.2 2種方法檢測陽性率評價 抗酸桿菌涂片檢測陽性標本采用實時FQ-PCR檢測全部為陽性，而抗酸桿菌涂片檢測陰性的92例標本采用實時FQ-PCR檢測陽性33例，陽性率為35.87%。

3 討 論

隨著社會的發展，人們的生活方式發生了多樣化改變，作息時間不規律，環境污染等外加因素的存在導致肺結核感染的發生過來越多。與此同時肺外結核發生率也呈逐年上升趨勢，由于肺外結核較為隱匿而難發現，一直以來均是困擾臨床醫生的問題，傳統檢測方法雖然簡便、快速、價廉，但靈敏度低，特異性差，且不能區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌感染，尤其是不能檢出L型和顆粒型結核分枝桿菌[4-5]。培養法是診斷結核病的“金標準”，精確可靠，特異性高。但其所需時間達4～8周，嚴重影響了結核病的早期診斷和及時治療。近年來隨著實時FQ-PCR技術的發展和在臨床的廣泛應用，肺外結核檢測陽性率明顯提高[6]。實時FQ-PCR由于是在常規PCR的基礎上加了熒光標記的探針，將核酸擴增、雜交及光譜技術結合在一起，實現了對目的基因的準確定量。該法特異性也較傳統檢測方法高，已得到臨床的一致認可[7-9]。

本研究通過對101例疑似肺外結核患者關節腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液及尿液等標本進行TB-DNA檢測結果顯示，關節炎組、胸腹膜炎組、淺表淋巴結核組、腎結核組、其他結核組TB-DNA陽性率分別為41.18%、37.50%、50.00%、46.15%、36.84%；而抗酸桿菌涂片檢測陽性率分別為11.76%、9.38%、10.00%、7.69%、5.26%；實時FQ-PCR檢測陽性率明顯高于抗酸桿菌涂片，差異均有統計學意義(P<0.05)?？顾釛U菌涂片檢測101例標本陽性率為8.91%，而實時FQ-PCR檢測TB-DNA陽性率達41.58%。二者比較差異有統計學意義(P<0.01)。

本研究對抗酸桿菌涂片檢測陰性的標本采用實時FQ-PCR檢測TB-DNA陽性率為35.87%，由此發現，抗酸桿菌涂片檢測的漏檢率較高，對患者臨床診斷影響很大，而抗酸桿菌涂片檢測陽性標本采用實時FQ-PCR檢測均為陽性。

本研究結果表明，采用實時FQ-PCR檢測患者關節腔穿刺液、胸腹腔穿刺液、淺表淋巴穿刺液及尿液診斷肺外結核具有靈敏度高、特異性強等特點，可作為臨床診斷肺外結核可靠的實驗方法，可廣泛應用于臨床檢測。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.040

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1673-4130(2016)02-0239-03

2014-11-17)