PCR-熒光法與PCR-膜雜交法在檢測HPV-DNA中的比較分析

趙一琳，崔映紅，黃少芝

(常熟市醫學檢驗所，江蘇常熟 215500)

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·論 著·

PCR-熒光法與PCR-膜雜交法在檢測HPV-DNA中的比較分析

趙一琳，崔映紅，黃少芝

(常熟市醫學檢驗所，江蘇常熟 215500)

目的 比較并分析PCR-熒光法與PCR-膜雜交法在臨床感染人乳頭瘤病毒(HPV)中的檢測結果，探討其不同的應用價值。方法 收集204例標本，分別采用PCR-熒光法與PCR-膜雜交法檢測HPV-DNA，以細胞組織學診斷為標準分為未見上皮內病變或惡性病變(NILM)組(152例)、意義不明的非典型鱗狀上皮細胞增生(ASC-H)組(27例)、鱗狀上皮細胞低度病變(LSIL)組(21例)、鱗狀上皮細胞高度病變(HSIL)組(2例)和宮頸鱗癌(SCC)組(2例)。比較各組患者HPV-DNA陽性率，通過統計學方法比較2種方法的差異性。結果 204例標本中PCR-熒光法檢測陽性67例，陰性137例，陽性率為32.8%。PCR-膜雜交法檢測陽性94例，陰性110例，陽性率為46.1%。細胞學診斷有異常細胞52例(25.5%)。NILM組患者2種方法檢測HPV陽性率分別為12.5%、28.3%，差異有統計學意義(χ2=11.670，P=0001)；細胞異常組患者2種方法檢測HPV陽性率分別為92.3%、98.1%，差異無統計學意義(χ2=1.891，P=0.363)；細胞異常組患者2種方法檢測HPV陽性率與NILM組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 PCR核酸擴增檢測HPV-DNA具有很高的特異性與靈敏度。在臨床篩查診療中PCR-熒光法具有更高的應用價值，而在非高危性HPV檢測領域和科研領域PCR-膜雜交法更具優勢。HPV-DNA檢測結合細胞組織病理學檢查可提高HPV感染診斷的準確性與臨床指導意義。

乳頭狀瘤病毒科; 聚合酶鏈反應; 熒光; 膜雜交法

人乳頭瘤病毒(HPV)是婦女生殖道感染的常見病原體，是宮頸上皮內瘤變(CIN)和宮頸癌的主要病因。有研究表明，99%宮頸癌患者存在HPV感染，在美國至少有80%婦女到50歲時有過一次以上HPV感染史[1]。由于HPV感染與宮頸癌的高度相關性，而HPV陰性者幾乎很少發生宮頸癌；且HPV感染與宮頸癌的發生具有時序關系，不同亞型HPV在致病性方面均存在差異[2]，所以在臨床對宮頸癌的篩查中進行HPV及其分型檢測是一項極其重要的檢查手段。HPV分型檢測對臨床CIN和宮頸癌篩查和評估、治療后的隨訪、病程進展監測及人群流行病學狀態和病毒疫苗的研制均具有重要意義。目前國內臨床進行HPV DNA檢測的主要方法為實時熒光PCR與雜交捕獲法[3]。本研究采用PCR-熒光法與PCR-膜雜交法同時檢測臨床標本中的HPV并以細胞學診斷作為依據對檢測結果進行分析和評估，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2014年12月江蘇省常熟市第二人民醫院婦科門診患者204例作為研究對象，年齡20～60歲，平均(36.5±7.0)歲，均存在性生活史并自愿接受細胞學和HPV病毒學檢測。所有檢測標本均為從受檢者宮頸口鱗、柱狀上皮交界處采集，使用一次性棉拭子。采樣前拭去宮頸口過多分泌物，將宮頸刷伸入宮頸外口，輕壓旋轉取得脫落細胞。迅速將宮頸刷浸入盛有1 mL無菌生理鹽水的樣本管中，充分漂洗，貼壁擠干后即刻送檢。細胞學檢查標本采用專用脫落細胞采集器采集，即時送檢。

1.2 方法

1.2.1 PCR-熒光法 13 000 r/min離心5 min，取沉淀，采用港龍生物技術有限公司提供的試劑盒提取標本DNA，取2 μL待測DNA加入試劑盒提供的反應管。管內含有根據13種高危型HPV的L1基因靶序列設計一組高度特異的引物和探針，在同一PCR反應中檢測宮頸脫落細胞中的13種高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)DNA。反應參數為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，40個循環(95 ℃ 15 s，52 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min)。PCR-熒光法是在PCR過程中使用熒光PCR檢測儀同時記錄熒光標記探針在分子雜交時每次PCR循環釋放出的熒光能量變化，直接反映出PCR擴增產物量的變化。采用美國ABI 7500自動記錄熒光值變化并轉換成DNA模板量，用以判斷檢測結果。設立HPV陰性對照、臨界陽性對照和強陽性對照，以保證質量受到控制。

1.2.2 PCR-膜雜交法 該法采用基因擴增技術及導流雜交原理，通過反向點雜交檢測擴增產物與包被有型特異性探針膜雜交結果，再用堿性磷酸酶系統定性檢測，從而對21種HPV基因型(6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和CP8304)進行分型檢測分析。標本采集與DNA提取與PCR-熒光法相同，采用凱普生物化學有限公司提供的分型檢測試劑盒，將PCR Mix、Taq酶和DNA模板按比例混勻。擴增參數：95 ℃ 9 min，40個循環(95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。所有產物用于雜交過程，詳細步驟參照說明書操作。在顯色過后檢測結果陽性為清晰可見的藍紫色圓點。根據膜條HPV分型分布圖，判斷陽性點為何種HPV類型。全程設立陰、陽性對照。

1.3 細胞組織學檢查 根據2001年貝塞斯達分類系統(TBS)將宮頸鱗狀上皮細胞學檢查結果分為未見上皮內病變或惡性病變(NILM)、意義不明的非典型鱗狀上皮細胞增生(ASC-H)、鱗狀上皮細胞低度病變(LSIL)、鱗狀上皮細胞高度病變(HSIL)和宮頸鱗癌(SCC)。

1.4 統計學處理 應用SPSS19.0 統計軟件進行數據分析，計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗和相關性分析比較兩種方法的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞組織學檢查結果 204例受檢者中NILM 152例(74.5%)，提示存在細胞異常52例(25.5%)，其中ASC-H 27例，LSIL 21例，HSIL 2例，SCC 2例。

2.2 HPV-DNA檢測結果 細胞異常組2種方法的HPV-DNA檢出率均很高，PCR法檢測HPV-DNA具有很高的靈敏度與特異性。PCR-熒光法檢測陰性137例，陽性67例，陽性率為32.8%；NILM組檢測陽性19例，陽性率為12.5%，細胞異常組檢測陽性48例，陽性率為92.3%。PCR-膜雜交法檢測陰性110例，陽性94例，陽性率為46.1%；NILM組檢測陽性43例，陽性率為28.3%；細胞異常組檢測陽性51例，陽性率為98.1%。細胞異常組患者2種方法檢測HPV陽性率與NILM組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2種方法在細胞組織學分組中檢測陽性情況比較[n(%)]

*：與NILM組比較，P<0.05。

2.3 2種方法檢測結果比較 PCR-熒光法和PCR-膜雜交法在NILM組檢測陽性率分別為12.5%、28.3%，差異有統計學意義(P<0.05)；在細胞異常組檢測陽性率分別為92.3%、98.1%，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2種方法檢測結果比較[n(%)]

3 討 論

從方法學來看，PCR-膜雜交法也是建立在常規PCR基礎上的，增加膜雜交顯色過程，其檢測結果只能進行定性分析，以檢測位點出現信號與否進行判斷，信號點的強弱不能提供定量方面的參考。除PC位點外膜條上各檢測位點有信號，說明感染了相應的基因型，即使是混合型感染也能分辨[4]。但該法比PCR-熒光法多一步雜交顯色，操作步驟稍顯繁瑣，同時雜交顯色過程中增加了實驗室PCR產物污染的風險。PCR-熒光法是在常規PCR基礎上加入熒光標記探針，從擴增到檢測完均在封閉反應管內進行，從而避免了實驗室產物交叉污染的可能。PCR-熒光法可以實時熒光監測擴增過程并且能提供準確的半定量分析，結果可靠，非常適用于針對高危HPV亞型流行病學的篩查[5]。由于該法檢測宮頸HPV感染具有快速、簡便、準確的優點，且適用于多種樣本類型，成本相對較低，在嚴格進行實驗室質量控制的情況下，該法不失為臨床HPV檢測的一種理想方法[6-8]。

本研究結果顯示，HPV感染在細胞組織學分類檢測中呈現不同的陽性比例，NILM組明顯低于細胞異常組。從表1可見，PCR-熒光法與PCR-膜雜交法檢測結果均證明這一點，建立在PCR基礎上的HPV-DNA檢測技術具備很高的靈敏度與特異性。2種方法在細胞異常組檢測陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明HPV感染與宮頸病變具有直接相關性。但在NILM組中2種方法檢測陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)，主要原因在于PCR-熒光法檢測目標群只局限于13種類型的高危HPV，而PCR-膜雜交法可以檢測21種類型的HPV亞型，不僅包括PCR-熒光法所含的13種高危型，還能檢測5種低危型(HPV6、11、42、43、44)及2種高危型(HPV66、CP8304)[7]。

PCR-膜雜交法可以對患者所感染的HPV進行高危和低危分型，能通過一次實驗檢測獲得相對較多的檢驗信息。PCR-膜雜交法可明確患者具體所感染的HPV類型，對判斷多重感染和療效監測有著較大的應用價值。但也有研究表明，只有高危型HPV基因組能整合進宿主細胞染色體內，精確的分型檢測具有的臨床診療意義不大，其在學術研究、病毒感染與組織病變的機制關系及疫苗研發方面等具有更大的應用價值[9]。PCR-熒光法與PCR-膜雜交法比較具有時間短、操作簡單、交叉污染少、可以允許同一反應墊板更多具備臨床意義的高危HPV類型，可適用于大批量樣本的篩查[10]。同時PCR-熒光法還提供了半定量分析，檢測臨床標本中的病毒DNA承載量，這對于預測宮頸病變的危險程度具有一定應用價值[11]。

總之，HPV的檢測方法學選擇應根據患者自身病情的實際需求，選擇更適合于臨床診療需求的HPV檢測方法。一方面能更快速、準確地進行檢測分析；另一方面能為臨床醫生提供更有價值的檢驗信息。

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The comparative analysis on the detection of HPV-DNA by PCR- fluorescence and PCR-membrane hybridization

ZhaoYilin，CuiYinghong，HuangShaozhi

(ChangshuMedicalTestingCenter，Changshu，Jiangsu215500，China)

Objective To explore different application of PCR- fluorescence method and PCR- hybridization method in the diagnosis of human papilloma virus (HPV) infection.Methods Clinical samples were collected and detected by PCR- fluorescence method and PCR- hybridization method respectively.The cell histological diagnosis was used to compare the positive rate of HPV-DNA detection between the two methods，and the difference was analyzed by statistical method.The specimens were divided into no intraepithelial lesion or malignancy(NILM) group(152 cases),atypical squamous cell hyperplasia of unknown significance(ASC-H) group (27 cases),low-grade squamous intraepithelial lesion(LSIL) group(21 cases),high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL) group (2 cases) and squamous cell cervical carcinoma(SCC) group (2 cases).Results Among 204 cases of specimens，the results of PCR- fluorescence showed 67 cases were positive，137 cases were negative，the positive rate was 32.8%.The detection results of PCR- membrane hybridization showed 94 cases were positive，110 cases were negative，the positive rate was 46.1%.52 cases with abnormal cells were found by using cytological examination，the proportion is 25.5%.Within NILM group PCR- fluorescence method and PCR- membrane hybridization HPV positive rates were 12.5% and 28.3% respectively，the difference was statistically significant(P<0.05).Meanwhile the positive rate in the group of abnormal cells were 92.3% and 98.1%，the difference was not statistically significant(P>0.05).At the same time，the difference was statistically significant between the positive rate of abnormal HPV cell group and the NILM group(P<0.05).Conclusion HPV-DNA detected by PCR are specific and sensitive.During clinical diagnosis and treatment，PCR- fluorescence method has higher application value，while in the detection and research of low-risk HPV，PCR membrane hybridization has more advantages.The detection of HPV-DNA combined with cell histological diagnosis can improve the diagnostic accuracy of HPV viral infection.

papillomaviridae； polymerase chain reaction； fluorescence； membrane hybridization

趙一琳，女，主管檢驗技師，主要從事分子生物學檢驗的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.025

A

1673-4130(2016)02-0205-03

2015-08-16)