二至天癸顆粒對(duì)初老小鼠胚胎線粒體膜電位及發(fā)育潛能的影響

郭穎,連方

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

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二至天癸顆粒對(duì)初老小鼠胚胎線粒體膜電位及發(fā)育潛能的影響

郭穎1，2,連方2

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察補(bǔ)腎中藥二至天癸顆粒對(duì)初老小鼠胚胎線粒體膜電位(ΔΨm)及早期胚胎發(fā)育潛能的影響。方法 將80只初老(12月齡)小鼠隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組各40只，分別給予二至天癸顆粒、安慰劑灌胃，連續(xù)給藥10 d；兩組小鼠進(jìn)行超促排卵，收集卵細(xì)胞進(jìn)行體外受精；觀察受精及胚胎發(fā)育情況，計(jì)算受精率及正常卵裂率；取二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞胚胎以及?？芭吆湍遗?，采用JC-1染色法檢測(cè)各期胚胎ΔΨm。結(jié)果 治療組小鼠受精率為52.9%(656/1 240)、正常卵裂率為83.2%(546/656)，對(duì)照組分別為37.0%(414/1 120)、65.2%(270/414)；兩組受精率、正常卵裂率比較，P均<0.05。在二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞、桑椹胚及囊胚期，治療組ΔΨm均高于相同細(xì)胞時(shí)期的對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 補(bǔ)腎中藥二至天癸顆?？赡芡ㄟ^(guò)改善初老小鼠胚胎ΔΨm，進(jìn)而提高受精率、卵裂率，從而改善卵母細(xì)胞質(zhì)量及早期胚胎的發(fā)育潛能。

補(bǔ)腎法；二至天癸顆粒；中藥；線粒體膜電位；卵母細(xì)胞；早期胚胎；初老小鼠

隨著國(guó)家出臺(tái)全面二孩政策，高齡婦女的生育問(wèn)題成為目前生殖醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)問(wèn)題。然而，生育能力隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸下降，尤其是35歲以上的婦女，卵細(xì)胞質(zhì)量降低是生育能力顯著下降的重要原因[1，2]。線粒體作為與早期胚胎發(fā)育潛能密切相關(guān)的供能結(jié)構(gòu)，其性狀直接影響胚胎質(zhì)量及體外受精的結(jié)局。隨著對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)的深入研究，可在細(xì)胞器水平對(duì)卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育潛能進(jìn)行評(píng)估[3]。在中醫(yī)學(xué)“腎主生殖”理論指導(dǎo)下，中醫(yī)藥在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越受到學(xué)者的關(guān)注。2015年9月～2016年3月，我們以線粒體膜電位(ΔΨm)為切入點(diǎn)，觀察補(bǔ)腎中藥二至天癸顆粒對(duì)初老小鼠胚胎ΔΨm的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 12月齡(初老)健康昆明雌鼠80只，3月齡(壯年)健康昆明雄鼠40只，體質(zhì)量(35±5)g，由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK(魯)20030004；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在(25±2)℃ 室溫、明暗交替各12 h 的條件下飼養(yǎng)。二至天癸顆粒購(gòu)買(mǎi)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,主要成分為女貞子、旱蓮草、枸杞子、菟絲子、當(dāng)歸、白芍、川芎、熟地黃、制香附、炙甘草等；安慰劑，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供，主要由糊精組成。人絕經(jīng)期尿促性腺激素(HMG，批號(hào)：160501)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，批號(hào)：160503)，均由麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)。受精輸卵管培養(yǎng)液、卵裂輸卵管培養(yǎng)液、緩沖輸卵管培養(yǎng)液及組織培養(yǎng)油、人血清白蛋白、即用型透明質(zhì)酸酶，均購(gòu)自美國(guó)SAGE公司。ΔΨm檢測(cè)試劑盒(JC-1)，購(gòu)自武漢碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與干預(yù)處理 將80只雌性小鼠隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組各40只，分籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，每日下午定時(shí)連續(xù)灌胃給藥10 d；治療組用二至天癸顆粒，對(duì)照組用安慰劑。運(yùn)用人與動(dòng)物的體表面積計(jì)算法進(jìn)行計(jì)算[4]，每日喂藥量為0.1 g/d。

1.2.2 卵母細(xì)胞收集 第11天兩組腹腔內(nèi)注射HMG 10 IU/只。48 h后腹腔內(nèi)注射HCG 1O IU/只；于注射HCG后14 h剖腹取出小鼠卵巢及輸卵管，收集并處理卵丘復(fù)合物，評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量。將處理好的卵母細(xì)胞移入緩沖輸卵管培養(yǎng)液中，反復(fù)洗滌6次后置于受精輸卵管培養(yǎng)液，放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.2.3 精子獲取 取3月齡健康昆明雄鼠40只，剖腹取其附睪及輸精管；于緩沖輸卵管培養(yǎng)液中用TB針?biāo)核?，精子游出；放?7 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1 h獲能備用。

1.2.4 體外受精和培養(yǎng) 用上游洗滌法洗滌精液，以5×106/mL活精子加入成熟卵母細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行受精，4～6 h觀察受精情況，計(jì)算受精率(受精卵細(xì)胞數(shù)/卵細(xì)胞總數(shù)×100%)；在卵裂輸卵管培養(yǎng)液中將受精卵繼續(xù)培養(yǎng)96～120 h，觀察胚胎發(fā)育情況，計(jì)算正常卵裂率(正常卵裂球數(shù)/受精卵總數(shù)×100%)。

1.2.5 各期胚胎ΔΨm檢測(cè) 采用JC-1染色法。取二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞胚胎以及?？芭吆湍遗?，于胚胎的卵裂輸卵管培養(yǎng)液中培養(yǎng)。37 ℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱30 min，JC-1染色工作液按照1∶1比例加入培養(yǎng)液中染色25 min。緩沖輸卵管培養(yǎng)液反復(fù)沖洗胚胎數(shù)次，熒光顯微鏡下于綠色和紅色熒光模塊下觀察。用LUCIAG軟件獲得圖像，并分別測(cè)量同一胚胎的綠色及紅色熒光強(qiáng)度值，兩者比值即為ΔΨm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠受精率、正常卵裂率比較 治療組小鼠受精率為52.9%(656/1 240)、正常卵裂率為83.2%(546/656)，對(duì)照組分別為37.0%(414/1 120)、65.2%(270/414)；兩組受精率、正常卵裂率比較，P均<0.05。

2.2 兩組小鼠各階段胚胎ΔΨm比較 在二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞、桑椹胚及囊胚期，治療組ΔΨm均高于相同細(xì)胞時(shí)期的對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠各階段胚胎ΔΨm比較

注：與對(duì)照組同細(xì)胞時(shí)期比較，*P<0.05。

3 討論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，在堅(jiān)持胚胎宏觀形態(tài)學(xué)分析的基礎(chǔ)上，胚胎的微觀形態(tài)學(xué)研究受到越來(lái)越多的重視，為臨床優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇提供了更準(zhǔn)確的依據(jù)。因此，關(guān)于胚胎各種胞質(zhì)因子、線粒體、紡錘體等的研究越來(lái)越多。線粒體有著重要的基礎(chǔ)和臨床研究意義，可以提供能量并具有遺傳功能。有研究證實(shí)，隨著年齡的增加，卵細(xì)胞線粒體抵抗損傷能力逐漸下降；在相同的外部刺激發(fā)生時(shí)，更容易產(chǎn)生功能缺失[5]。高齡婦女的抗氧化能力下降，腺苷三磷酸(ATP)提供的能量減少，阻礙了發(fā)生于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)染色體的正常分離，導(dǎo)致非整倍體胚胎的形成，這正是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和胚胎反復(fù)種植失敗的因素之一[6～8]。

在卵細(xì)胞和胚胎發(fā)育的初期，線粒體多不成熟；發(fā)育到桑葚胚時(shí)，從形態(tài)學(xué)上分析一定比例的不成熟線粒體向成熟線粒體轉(zhuǎn)化；直至囊胚期，胞內(nèi)線粒體基本上全部轉(zhuǎn)化為成熟線粒體[9]。在人第2次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞中，經(jīng)由電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)10萬(wàn)～30萬(wàn)個(gè)線粒體，線粒體DNA(mtDNA)經(jīng)由PCR檢測(cè)為2萬(wàn)～80萬(wàn)個(gè)。mtDNA是評(píng)估卵細(xì)胞受精能力的重要指標(biāo)之一，其數(shù)量減少將導(dǎo)致卵母細(xì)胞受精能力下降[10]。有研究已經(jīng)在受精失敗的卵細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，mtDNA只有2萬(wàn)～6萬(wàn)個(gè)[11]。因此，可以推測(cè)正是由于低含量的mtDNA使卵母細(xì)胞正常的成熟受到影響，從而使這些卵母細(xì)胞發(fā)生受精障礙或影響胚胎的發(fā)育潛能[12～14]。卵母細(xì)胞與精子結(jié)合形成受精卵，繼續(xù)分裂形成胚胎，在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞數(shù)目是不斷增加的。但是，這期間線粒體數(shù)目是不隨著細(xì)胞數(shù)目增加而增多的，只能以提高自身功能、釋放大量ATP的方式來(lái)滿足細(xì)胞的能量需求。Van Blerkom等[15]發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，成熟卵母細(xì)胞的ΔΨm降低，卵母細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能也隨之降低。

本研究結(jié)果顯示，在不同的胚胎階段，治療組鼠胚的ΔΨm與對(duì)照組相比活性更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明，線粒體功能正常與否直接關(guān)系到卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎的發(fā)育潛能。當(dāng)線粒體的功能減弱時(shí)，產(chǎn)生的ATP量不足以支撐卵母細(xì)胞的受精、受精卵的分裂和胚胎的繼續(xù)發(fā)育。當(dāng)線粒體的功能過(guò)于增強(qiáng)時(shí)，ATP的產(chǎn)量過(guò)剩，細(xì)胞中出現(xiàn)大量的有害物質(zhì)從而使氧化磷酸化過(guò)程受阻，進(jìn)而影響胚胎的發(fā)育潛能。與對(duì)照組相比，治療組各階段發(fā)育的鼠胚其ΔΨm均有提高，而ΔΨm與ATP呈正相關(guān)。因此，我們的研究顯示，二至天癸顆粒可改善卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育，該作用可能是通過(guò)提高ΔΨm和ATP含量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本研究以ΔΨm為切入點(diǎn)，將祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)相結(jié)合，探討二至天癸顆粒影響初老小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量及早期胚胎發(fā)育潛能的機(jī)制。隨著年齡的增加，女性腎氣漸衰，卵巢功能減弱，生殖能力低下，這與《內(nèi)經(jīng)》的七七理論是一致的。在臨床治療中，女性生殖功能下降以補(bǔ)腎為主。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎中藥二至天癸顆?？商岣擀う穖來(lái)改善卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能，為臨床補(bǔ)腎中藥提高卵細(xì)胞質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，從分子水平豐富了腎主生殖理論的科學(xué)內(nèi)涵。但本研究也有一定的局限性，樣本量較少，只是從實(shí)驗(yàn)研究的角度進(jìn)行了探討，下一步我們將進(jìn)行大樣本、多中心的隨機(jī)雙盲臨床研究，使傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，為生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新思路。

[1] Romundstad LB ,Romundstadt PR, Sunde A, et al. Effects of technology or maternal factors on perinatal outcome after assisted fertilization: a population-based cohort study[J]. Lancet, 2008,372(9640):737-743.

[2] Eichenlaub-Ritter U, Wieczorek M, Lüke S, et al. Age related changes in mitochondrial function and new approaches to study redox regulation in mammalian oocytes in response to age or maturation conditions[J]． Mitochondrion, 2011,11(5):783-796．

[3] Ishii T. Potential impact of human mitochondrial replacement on global policy regarding germline gene modification[J]． Reprod Biomed Online, 2014,29(2): 150-155．

[4] 苗明三.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2003:143-144.

[5] Thouas GA, Trounson AO, Jones GM. Effect of female age on mouse oocyte developmental compentce following mitochondrial injury[J]. Bio Reprod, 2005,73(2): 366-373.

[6] de Bruin JP, Dorland M, Spek ER, et al. Age-related changes in the ultrastructure of the resting follicle pool in human ovaries[J]. Biol Reprod, 2004,70(2):419-424.

[7] Santos TA, SS, St John JC. Mitochondrial content reflects oocyte varia-bility and fertilization outcome[J]. Fertil Steril, 2006,85(3):584-591.

[8] 李海霞,謝妍, 郭新宇,等.經(jīng)后增殖方和促黃體方能誘導(dǎo)超促排卵小鼠子宮內(nèi)膜中整合素β3的表達(dá)[J].生殖與避孕,2012,32(11):799-803.

[9] Reynier P, May-Panloup P, Chretien M, et al. Mitochondrial DNA content affects the fertilizability of human oocytes[J]. Mol Hum ReProd, 2001,7(5):425-429.

[10] 譚美玲,莊廣倫.如何改善卵母細(xì)胞質(zhì)量[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2015,24(10):775-778.

[11] 李琰珉,王峰,李琰琳.生殖細(xì)胞能量代謝與女性生育能力關(guān)系的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2015,55(18):99-101.

[12] Cotterill M, Harris SE, Fernandez E, et al. The activity and copy number of mitochondrial DNA in ovine oocytes throughout oogenesis in vivo and during oocyte maturation in vitro[J]. Mol Hum Reprod, 2013,19(7):444-450.

[13] Bezzaouia A, Gallo A, Silcestre F, et al. Distribution pattern and activity of mitochondria during oocyte growth and maturation in the ascidian Styela plicata[J]. Zygote, 2014,22(4):462-469.

[14] Chen C, Han S, Liu W, et al. Effect of vitrification on mitochondrial membrane potential in human metaphaseⅡ oocytes[J]. J Assist Reprod Genet, 2012,29(10):1045-1050.

[15] Van Blerkom J, Davis P, Alexander S. Differential mitochondrial distribution in human pronuelear embryos leads to disproportionate inheritance between blastomeres: relationship to microtubular organization, ATP content and competence[J]. Hum Reprod, 2000,15(12):2621-2633.

·臨床研究·

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273790，81473720)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015WSB23005)。

連方(E-mail: f_lian@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.013

R2-031

A

1002-266X(2016)42-0043-03

2016-08-12)