胰島素樣生長因子1對新生大鼠高氧肺損傷的影響及其機制探討

許春花，薛東生，金正勇

(1延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000；2開封市兒童醫院)

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胰島素樣生長因子1對新生大鼠高氧肺損傷的影響及其機制探討

許春花1，薛東生2，金正勇1

(1延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000；2開封市兒童醫院)

目的 觀察胰島素樣生長因子1(IGF-1)對高氧誘發肺損傷的影響，并探討其可能的機制。方法 將出生后第1天的240只大鼠隨機分為3組各80只，模型組和干預組持續暴露于85% O2模型箱中，對照組置于室外呼吸空氣。干預組出生第1天始每天腹腔注射雙蒸水稀釋的rhIGF-1 1 μg/kg，連續14 d。第1、3、7、14天，測定肺濕重/干重(W/D)值，用細胞計數板計數支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的白細胞，Western blot法檢測肺組織內質網應激(ERS)關鍵蛋白Caspase-12。結果 與對照組比較，模型組和干預組隨著吸入高氧時間的延長，肺W/D值、BALF中白細胞數及肺組織中Caspase-12相對表達量增加，第3、7、14天均有統計學意義(P均<0.05)；與模型組同時點比較，干預組肺W/D值、BALF中白細胞數及肺組織中Caspase-12相對表達量均降低，第3、7、14天均有統計學意義(P均<0.05)。結論 新生大鼠腹腔注射IGF-1能抑制高氧所致肺損傷，可能與其下調肺組織中ERS相關的Caspase-12蛋白表達有關。

肺損傷；高氧;新生大鼠；胰島素樣生長因子1；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12

支氣管肺發育不良(BPD)是新生兒高氧、機械通氣治療的常見并發癥，病因尚不明確。研究已證實，內質網應激(ERS)參與肺損傷的發生、發展，而ERS在BPD中的作用及其機制尚不清楚。Caspase-12是一個內質網常駐細胞凋亡蛋白酶，在ERS條件下被激活，并可調控細胞凋亡。胰島素樣生長因子1(IGF-1)作為體內重要的生長因子，對組織細胞的增殖、分化、凋亡及機體的生長發育起重要調節作用。已證實IGF-1可防治高氧肺損傷，但其作用機制尚不清楚。2014年5月～2015年12月，我們制備了常壓持續高氧誘導的新生大鼠肺損傷模型，觀察高氧后大鼠肺水腫、炎癥反應及Caspase-12蛋白表達情況，進一步探討IGF-1是否通過ERS信號途徑減輕高氧肺損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 孕22 d新生Wistar大鼠，購自延邊大學動物科，動物許可證號：SYXK(吉)2007-0011；rhIGF-1(Sigma公司)，Caspase-12抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模干預 足月新生Wistar大鼠240只，生后第1天隨機分為3組，每組80只；模型組和干預組持續暴露于85% O2模型箱中，對照組置于室外呼吸空氣。干預組出生第1天起每天腹腔注射雙蒸水稀釋的rhIGF-1 1 μg/kg，連續14 d。

1.2.2 肺水腫觀察 分別于造模第1、3、7、14天每組各取10只，以10%水合氯醛0.7 mL灌腸麻醉后，剪開胸腔，暴露肺組織；分離氣管及肺臟，結扎右支氣管，取下右肺，輕輕擦干表面，立即稱重，記為肺濕重；置于80 ℃烤箱內，每天稱重直至連續2 d無明顯變化，記為肺干重。計算肺濕重/干重(W/D)值，表示肺水腫程度。

1.2.3 肺組織炎性反應觀察 分別于造模第1、3、7、14天每組各取5只，以10%水合氯醛0.7 mL灌腸麻醉后，沿正中線切開頸胸部，并剝離氣管周圍的肌組織，暴露氣管頸段并切開。將細靜脈管插入氣管中，注入1 mL的生理鹽水溶液，然后回抽，獲得BALF。4 ℃下將BALF以1 300 r/min離心 10 min，去除上層液；余下細胞用適量生理鹽水溶液再懸浮，用細胞計數板進行白細胞計數。

1.2.4 肺組織Caspase-12蛋白檢測 采用Western blot法。分別于造模第1、3、7、14天每組各取5只，以10%水合氯醛0.7 mL灌腸麻醉后，打開胸腔取出肺組織；將肺組織置于9 g/L鹽水中漂洗后，浸泡于液氮中速凍，-70 ℃冰箱內保存。常規勻漿、離心制備組織蛋白抽提液，提取上樣以8%聚丙烯酰胺凝膠進行還原性SDS-PAGE電泳，半干式轉膜(PVDF膜)，300 mA恒流40 min。封閉液封閉后PVDF膜過夜，TBS-T緩沖液中充分振蕩清洗，分別滴加一、二抗(終濃度稀釋比例為1∶2 000)，ECM顯色。X線片曝光后顯影、定影、晾干。通過凝膠成像系統掃描分析，將目的蛋白與β-actin條帶吸光度比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組新生大鼠肺W/D值比較 模型組和對照組第1天新生大鼠肺W/D值無明顯變化，第3、7、14天時模型組肺W/D值明顯增加且高于對照組(P均<0.05),干預組第3、7、14天肺W/D值低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組新生大鼠肺W/D值比較

注：與對照組同時點比較，*P<0.05；與模型組同時點比較，#P<0.05；與同組第1天比較，△P<0.05；與同組第3天比較，□P<0.05。

2.2 各組新生大鼠BALF中白細胞數量比較 模型組隨著吸入高氧時間的延長BALF中白細胞數增加，各時點均比對照組增多，干預組第3、7、14天時BALF中白細胞數比模型組減少，P均<0.05。見表2。

表2 各組新生大鼠BALF中白細胞數量比較

注：與對照組同時點比較，*P<0.05；與模型組同時點比較，#P<0.05；與同組第1天比較，△P<0.05；與同組第3天比較，□P<0.05。

2.3 各組新生大鼠肺組織Caspase-12蛋白相對表達量比較 模型組隨著吸入高氧時間延長肺組織Caspase-12蛋白相對表達量增加，各時點均比對照組增多，干預組第3、7、14天時肺組織Caspase-12蛋白相對表達量比模型組減少，P均<0.05。見表3。

表3 各組新生大鼠肺組織Caspase-12蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組同時點比較，*P<0.05；與模型組同時點比較，#P<0.05；與同組第1天比較，△P<0.05；與同組第3天比較，□P<0.05。

3 討論

目前認為BPD的發生是由多因素引起，在遺傳易感性的基礎上，由肺發育不成熟、肺損傷和損傷后的異常修復所致。目前高氧是肺損傷的重要原因，吸入高氧與BPD的發生密切相關。梁斐等[1]研究發現，持續吸入高氧可導致新生大鼠的肺血管發育障礙，肺組織血管生成素1表達下調可能參與新生兒BPD血管發育受阻的發生機制。由于新生大鼠生后前2周是肺泡與肺血管發育的關鍵時期，本實驗這種短期的新生大鼠高氧模型，包含了肺泡發育的初始階段，這與新生兒出生后立即接受氧療相類似。結果顯示，觀察組和模型組吸入高氧后，新生大鼠肺W/D值、BALF中白細胞數量逐漸增加。表明高氧可以引起肺水腫及炎性反應，從而影響肺泡及肺血管發育。

內質網是細胞內重要細胞器，參與蛋白質翻譯后的修飾、折疊和寡聚化，未折疊或錯誤折疊蛋白的增多、胞內鈣的失衡引起ERS。有研究[2]報道，ERS誘導的細胞凋亡參與大鼠肢體缺血再灌注后肺損傷；亦有報道[3～5]，ERS與高氧肺損傷密切相關。肺損傷時，未折疊蛋白反應信號通路在BPD中起靶點作用[6]。Caspase-12存在于內質網膜上，其前體以酶原的形式與TNF-α相連接；活化的Caspase-12進一步激活Caspase-9和Caspase-3，引起細胞凋亡，故認為Caspase-12是內質網特異性凋亡的關鍵[7]。本研究結果顯示，模型組高氧第3、7、14天時Caspase-12蛋白相對表達量增高，第7天時達高峰。這表明內質網相關的細胞凋亡信號在高氧肺損傷中高表達，進一步證實ERS參與高氧肺損傷過程。

IGF-1是體內重要的生長因子，在細胞凋亡調控方面起重要作用，對高氧肺損傷保護作用已被肯定[8，9]。劉漢楚等[10]報道，新生大鼠肺發育過程中，如果在肺泡化期暴露于高氧環境，可使肺內IGF-1表達降低[11,12]。有研究[13]發現，小鼠氣管內滴入攜帶IGF-1基因的重組腺病毒5質粒可防止吸入性肺損傷，其機制為保護肺泡Ⅱ型上皮細胞，提高肺組織及血清IGF-1含量[14,15]。肺泡Ⅱ型上皮細胞是高氧肺損傷的主要靶細胞，其增殖及凋亡對高氧肺損傷的修復起主要作用[16]。本研究結果表明，干預組肺W/D值與同時點模型組相比明顯降低，表明IGF-1能降低高氧肺水腫程度；干預組BALF中白細胞數比模型組降低，證實IGF-1能阻止炎細胞浸潤，說明IGF-1能抑制高氧肺組織炎癥反應，與文獻[17]報道一致。有研究報道，隨著高氧暴露時間的延長，大鼠肺損傷加重、肺細胞凋亡增加，而外源性IGF-1能夠有效抑制肺細胞凋亡[18]。本研究結果顯示，模型組肺組織Caspase-12蛋白表達上調，而干預組較模型組蛋白表達下調。提示IGF-1通過作用于Caspase-12影響細胞凋亡。因此，IGF-1可通過顯著抑制ERS相關細胞凋亡信號通路，從而減輕高氧肺損傷。

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國家自然科學基金資助項目(81160083)；吉林省衛生計生科研計劃項目(2014Z095)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.011

R364

A

1002-266X(2016)42-0037-03

2016-02-17)