白花丹參提取物對阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力的影響及機制

王璐，趙傳怡，孫利利，王浩，劉超，王惠

(1青島市商業職工醫院,山東青島266011；2泰山醫學院藥學院；3青島大學附屬醫院)

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白花丹參提取物對阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力的影響及機制

王璐1，趙傳怡2，孫利利2，王浩2，劉超3，王惠3

(1青島市商業職工醫院,山東青島266011；2泰山醫學院藥學院；3青島大學附屬醫院)

目的 觀察白花丹參醇提物和水提物對阿爾茨海默病(AD)小鼠學習記憶能力的影響，并初步探討其機制。方法 將90只小鼠隨機分為6組各15只，A、B組分別給予白花丹參水提物20、40 g/kg灌胃，C、D組分別給予白花丹參醇提物10、20 g/kg灌胃，E、F組均給予等容量生理鹽水灌胃，每天1次，連續灌胃14 d。給藥7 d后，F組側腦注射生理鹽水溶液，其余各組均側腦注射β淀粉樣蛋白溶液制作AD模型。造模1周后以Y型迷宮觀察小鼠學習記憶能力，采用化學熒光法檢測腦組織活性氧(ROS)及總超氧化物歧化酶(T-SOD)。結果 E組較F組學習和記憶的錯誤次數均增多，腦組織勻漿中ROS升高、T-SOD降低(P均<0.01)；A～D組較E組學習和記憶的錯誤次數減少，腦組織勻漿中ROS降低、T-SOD升高(P均<0.05)；A、B、C、D組兩兩比較，P均>0.05。結論 白花丹參提取物可明顯改善AD小鼠的學習記憶能力，其機制可能與抗氧化有關。

阿爾茨海默病；白花丹參；β淀粉樣蛋白；學習記憶；活性氧；超氧化物歧化酶;小鼠

阿爾茨海默病(AD)是中樞神經系統退行性疾病[1～4]，但目前尚無有效的治療方法。因此，尋找有效防治AD的藥物至關重要。丹參具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩之功效，有研究發現其能明顯改善AD癥狀[5]。本課題組前期研究[6，7]發現，白花丹參提取物具有明顯的益智作用，但對于AD是否有防治作用，尚不明確。2014年5月～2015年5月，我們觀察了白花丹參醇提物和水提物對AD模型小鼠學習記憶能力的影響，并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種小鼠120只，雌雄各半，體質量18～22 g，由泰山醫學院實驗動物中心提供，選擇活躍且對電擊反應較敏感的90只進入實驗；白花丹參秋季采自泰山東麓，并經泰山醫學院中藥研究所鑒定，按文獻獲得其水提物和醇提物[8，9]；β淀粉樣蛋白(Aβ)購于Sigma公司，活性氧(ROS)測定試劑盒購于南京凱基生物有限公司，總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥處理 將90只小鼠隨機分為6組各15只，A、B組分別給予白花丹參水提物20、40 g/kg灌胃，C、D組分別給予白花丹參醇提物10、20 g/kg灌胃，E、F組均給予等容量生理鹽水灌胃，每天1次，連續灌胃14 d。給藥7 d后，F組側腦注射生理鹽水溶液，其余各組均側腦注射Aβ溶液制作AD模型[10]。

1.2.2 小鼠學習記憶能力觀察[11]造模7 d后，小鼠末次給藥24 h后進行Y型迷宮測試。實驗在三等分的Y型迷宮進行，工作電壓30～80 V，迷宮3個末端小區可按Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ的輪換順序分別作為起步區或安全區。小鼠受到電擊后，直接由起步區逃至安全區為正確反應，否則均屬錯誤反應。先將老鼠放入Y型迷宮適應3 min，以1個實驗日內完成30次反應中的錯誤次數為學習成績；24 h后重復測驗，錯誤次數為記憶成績。

1.2.3 小鼠腦組織ROS檢測 采用化學熒光法。Y型迷宮測試結束后，頸椎脫臼處死小鼠，取出腦組織；制備勻漿，離心取上清。將上清液加于96孔板中，再加入1 mmol/L的DCFH-DA溶液，置于酶標儀中。37 ℃保溫，30 min后于激發波長為485 nm下檢測熒光強度。

1.2.4 小鼠腦組織T-SOD檢測 采用羥胺法。取小鼠腦組織制備1%勻漿，按T-SOD檢測試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 白花丹參提取物對AD小鼠學習記憶能力的影響 見表1。

表1 各組小鼠學習記憶的錯誤次數比較(次，±s)

注：與E組比較，*P<0.01；與F組比較，#P<0.05。

2.2 白花丹參提取物對AD小鼠腦組織勻漿中ROS、T-SOD水平的影響 見表2。

表2 各組小鼠腦組織勻漿中ROS、T-SOD水平比較

注：與E組比較，*P<0.01；與F組比較，#P<0.05。

3 討論

AD是一種與衰老相關、以認知功能下降為特征的漸進性腦退行性疾病。AD患者大腦皮質彌散性萎縮、神經元丟失、突觸減少，細胞外Aβ沉積形成老年斑是其特征性病理變化。Aβ聚集后具有神經毒性，誘導神經元凋亡，被認為是AD發生的關鍵分子[12]。因此，本文選用Aβ誘導AD模型。白花丹參味苦，微寒，歸心、肝經，有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩的功能[13]。研究表明[14，15]，丹參及復方丹參注射液能明顯提高實驗動物的學習記憶能力，而丹參酮能改善AD大鼠學習記憶障礙。本實驗通過Aβ所致學習、記憶障礙AD模型，觀察白花丹參提取物對小鼠學習、記憶能力的影響。實驗結果顯示，白花丹參水提物及醇提物均能明顯減少學習時的錯誤次數，增強小鼠學習記憶能力，說明白花丹參提取物具有改善AD的作用。

Aβ可誘導氧化損傷，在Aβ沉積形成淀粉樣斑塊時會產生H2O2；具有氧化還原活性的鐵在神經纖維纏結和Aβ沉積斑中增多，又會催化H2O2生成羥基，引起細胞氧化應激性損傷，從而損傷神經細胞。AD患者大腦特別是海馬區代謝活躍，需氧量大，極易產生自由基。線粒體作為細胞有氧呼吸的主要場所，也是產生和清除自由基的主要場所。Aβ可使線粒體功能受到損害，自由基不能及時清除而在細胞內堆積，從而對細胞產生毒性作用。本實驗結果表明，Aβ可致腦組織ROS升高、T-SOD下降，誘導氧化應激損傷，而白花丹參提取物能明顯地抑制Aβ誘導的氧化應激損傷。說明白花丹參對Aβ誘導AD小鼠學習記憶的保護作用與其抗氧化有關。

綜上所述，白花丹參水提物與醇提物均能夠顯著提高AD小鼠的學習記憶能力，該作用可能與抗氧化有關。因此，白花丹參在AD防治中具有一定開發應用前景。

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山東省泰安市科技發展引導計劃項目(20132107)。

王浩(E-mail: tywanghao_2005@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.010

R749.16；R969

A

1002-266X(2016)42-0035-02

2016-05-25)