癲癇大鼠海馬組織中脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶的表達變化

徐祖才，羅忠，陳倩，唐世容，黃浩

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003 )

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·基礎研究·

癲癇大鼠海馬組織中脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶的表達變化

徐祖才，羅忠，陳倩，唐世容，黃浩

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003 )

目的 觀察癲癇大鼠海馬腦組織中脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶(L-PGDS)的表達變化。方法 取35只大鼠，隨機分為觀察組30只和對照組5只，觀察組采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇持續狀態模型；對照組和觀察組建模后第1、3、7、14、30、60天各取5只，麻醉后斷頭取海馬組織，用Western bolt法檢測海馬組織L-PGDS蛋白，免疫熒光雙標技術對L-PGDS進行海馬區細胞定位。結果 對照組大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白相對表達量為0.172±0.007，觀察組建模后第1、3、7、14、30、60天大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白相對表達量分別為0.190±0.004、0.195±0.003、0.231±0.010、0.322±0.010、0.417±0.006、0.454±0.009；觀察組隨著建模時間延長L-PGDS蛋白相對表達量增加(P均<0.05)，且各時點均高于對照組(P均<0.01)。免疫熒光雙標檢測發現，L-PGDS主要表達于神經元的樹突和星形膠質細胞的胞質中。結論 L-PGDS在癲癇大鼠海馬組織中表達增加，可能參與了癲癇的發生發展過程，可作為癲癇診斷的分子標志物和治療靶點。

癲癇；脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶；海馬；匹羅卡品；氯化鋰；大鼠

癲癇是一種常見的慢性神經系統疾病，其發病與炎癥介質有關，而前列腺素是重要的炎癥介質之一[1]。脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶(L-PGDS)廣泛分布于中樞神經系統中，具有催化合成前列腺素D2(PGD2)和轉運親脂性物質等重要功能，其在體溫調節、睡眠周期建立、神經傳遞及疼痛反應[2]，以及神經元凋亡發生、細胞毒性等方面具有重要作用[3]。有研究[4]表明，PGD2與癲癇發作及發作后睡眠密切相關。然而，癲癇發作后L-PGDS在腦內表達是否有改變目前尚不清楚。2015年7月～2016年4月，我們擬用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇模型，通過Western blot法檢測大鼠海馬組織內L-PGDS蛋白，同時使用免疫熒光技術明確L-PGDS在腦組織中的表達部位，觀察大鼠癲癇后L-PGDS的表達變化過程，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性大鼠,體質量200～230 g,購于第三軍醫大學實驗動物中心,清潔級,許可證號：SCXK(渝)2012-0005。常規室溫分籠飼養,給予大鼠標準飼料及純凈飲水。動物處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。氯化鋰和匹羅卡品購于Sigma-Aldrich公司，兔抗鼠L-PGDS、β-actin單克隆抗體、小鼠抗兔GFAP及MAP2單克隆抗體購于Abcan公司，FITC標記及TRITC標記的山羊抗小鼠熒光二抗購于Santa Cruz公司，RIPA和DAPI購于杭州碧云天生物技術有限公司，水合氯醛、羊抗兔(二抗)、Triton X-100、PBS均由武漢博士德生物工程有限公司提供，蛋白垂直電泳儀及轉移電泳儀為北京六一儀器廠生產，激光共聚焦顯微鏡為德國 Leica公司生產。

1.2 分組與造模 取35只大鼠，隨機分為觀察組30只和對照組5只，觀察組采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇癲癇狀態模型；先腹腔注射氯化鋰127 mg/kg,18～20 h后腹腔注射匹羅卡品 20 mg/kg。按照Racine分級法分級，當發作達到4級以上且持續1 h為癲癇持續狀態，發作15 min后腹腔注射阿托品10 mg/kg拮抗其M膽堿能樣作用，發作1 h后給予安定10 mg/kg停止發作。觀察組分別于建模后第1、3、7、14、30、60天各取5只，以3.5%水合氯醛1 mL/100 g腹腔注射麻醉后迅速斷頭取海馬組織，放入-80 ℃冰箱備用。

1.3 大鼠海馬組織L-PGDS蛋白表達檢測 采用Western bolt法。將腦組織加入RIPA溶解后離心，取上清液進行蛋白定量。各上樣孔加入20 μL對應樣品，然后進行電泳、轉膜。5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗(抗L-PGDS，1∶1 000)置于4 ℃冰箱過夜。洗滌后加入二抗，常溫1 h后再次洗滌。使用發光劑后在暗室內用X線膠片曝光，掃描器掃描膠片后用IPP軟件統計灰度值。以目的條帶與β-actin條帶灰度比值表示L-PGDS蛋白相對表達量。

1.4 大鼠海馬組織內L-PGDS細胞定位觀察 采用免疫熒光雙標技術。取對照組與觀察組建模第60天的冰凍切片，滴加0.3%的Triton X-100于37 ℃的水浴箱內孵育15 min；PBS充分洗滌，用山羊血清封閉液進行封閉。將兔抗L-PGDS(1∶100)、小鼠抗膠質纖維酸性蛋白(GFAP，1∶1 000)及小鼠抗微管相關蛋白2(MAP-2，1∶10 000)抗體混合后滴于切片上，并置于4 ℃冰箱內過夜；次日取出后用PBS充分洗滌，避光下滴入FITC標記山羊抗兔熒光二抗及TRITC標記的山羊抗小鼠熒光二抗；經DAPI染色后使用甘油封片，在激光共聚焦掃描顯微鏡下采圖。L-PGDS呈紅色熒光，星形膠質細胞特異性標志物GFAP和神經元樹突特異性標志物MAP-2均呈綠色熒光，細胞核標志物DAPI呈藍色熒光。計數陽性表達細胞，計算陽性細胞百分比。

2 結果

2.1 兩組大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白表達比較 對照組大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白相對表達量為0.172±0.007，觀察組建模后第1、3、7、14、30、60天大鼠海馬組織中L-PGDS蛋白相對表達量分別為0.190±0.004、0.195±0.003、0.231±0.010、0.322±0.010、0.417±0.006、0.454±0.009；觀察組隨著建模時間延長L-PGDS蛋白相對表達量增加(P均<0.05)，且各時點均高于對照組(P均<0.01)。

2.2 兩組大鼠海馬組織中L-PGDS的細胞定位情況比較 免疫熒光雙標檢測發現，L-PGDS在對照組和模型組大鼠海馬組織的CA1區廣泛表達，并且與星形膠質細胞特異性標志物GFAP和神經元樹突特異性標志物MAP-2均共表達，而與細胞核標志物DAPI不共表達，提示L-PGDS主要表達于星形膠質細胞與神經元胞質和突起處。進一步用半定量分析發現，與對照組相比，觀察組建模第60天大鼠海馬CA1區L-PGDS與GFAP和MAP2共表達陽性細胞百分比分別為28.9%±2.4%、75.1%±6.6%，明顯高于對照組的15.6%±0.7%、49.4%±4.8%(P均<0.01)。

3 討論

腦內炎癥反應是癲癇發生及發展的重要因素。前列腺素是刺激炎癥反應發生的主要因素，而PGD2是前列腺素中主要炎癥介質之一。研究表明，PGD2可以明顯增加癲癇發作和發生頻率，且可以顯著降低癲癇發作的閾值[5]。本研究發現，L-PGDS在匹羅卡品誘導的癲癇大鼠海馬組織中表達升高，且隨時間延長其表達逐漸增加。進一步使用免疫熒光技術檢測表明，L-PGDS在大鼠海馬組織CA1區神經元及星形膠質細胞中均有表達，并且在觀察組大鼠海馬CA1區星形膠質細胞和神經元表達L-PDGS較對照組明顯升高。以上結果均表明，L-PGDS與癲癇發生發展有關。

到目前為止，通過對動物癲癇模型及癲癇患者的研究發現，癲癇的發生及發展與神經元、膠質細胞及血腦屏障功能變化相關[6,7]。目前，抗癲癇藥物(AEDs)的研究主要集中在離子通道、離子轉運、興奮/抑制性突觸傳遞等方面。然而，最近AEDs的抗炎作用備受關注。例如，卡馬西平和左乙拉西坦可減少培養的膠質細胞表達炎癥介質，以提供神經保護作用；通過對炎癥介質的調節，左乙拉西坦也可以使星形膠質細胞的靜息膜電位升高，從而減弱其興奮性，同時左乙拉西坦通過抑制炎癥介質的產生發揮抗驚厥作用[8,9]。

作為常見的炎性介質，已知PGD2有L-PGDS和H-PGDS兩種合酶合成[10]。他們通過相關的受體而發揮作用[11]。有研究報導，前列腺素D1受體(DP1R)、DP2R有各自的cAMP產生，并各自與Gs和Gi蛋白結合[12]。啟動DP1R可減少鈣離子內流，產生神經保護作用。然而，啟動DP2R卻可以增加鈣離子內流，產生鈣超載，加重細胞損害導致細胞死亡[13,14]，而PGD2的總效應則取決于細胞表達DP1和DP2的數量及細胞所處的病理狀態[15]。本實驗中，L-PGDS在癲癇模型中表達異常升高，可能參與了癲癇的發生發展過程；但L-PGDS是啟動DP1R還是DP2R目前尚不得而知，因此需進一步的研究去證實L-PGDS在癲癇大鼠中的作用靶點，以明確其對癲癇是保護性作用還是損害作用。通過對L-PGDS的進一步研究，使之有望成為臨床癲癇診斷的分子標志物和新的AEDs的治療靶點。

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國家自然科學基金資助項目(81260201，81660227)；貴州省科學技術基金資助項目[黔科合J字(2013)2327號]；省市合作項目-優秀青年科技人才培養項目[遵科合人(2014)10號]。

黃浩(E-mail: haohuang325@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.009

R742.1

A

1002-266X(2016)42-0032-03

2016-08-07)