他克莫司口服復合物膠束的制備及其體外釋藥特性觀察

焦艷，李凌冰，牟燕，徐巍

(1山東大學藥學院，濟南250012；2山東省千佛山醫院)

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他克莫司口服復合物膠束的制備及其體外釋藥特性觀察

焦艷1，李凌冰1，牟燕2，徐巍2

(1山東大學藥學院，濟南250012；2山東省千佛山醫院)

目的 制備載他克莫司的口服復合物膠束，觀察其理化性質及體外釋藥特征。方法 采用薄膜超聲法以普朗尼克F127-殼聚糖聚合物(F127-CS)和脫氧膽酸鈉(DCA)為材料制備他克莫司口服大分子復合物膠束，采用單因素考察和均勻設計篩選最優制備工藝；透視電鏡下觀察膠束外觀形態，激光散射粒度儀測定粒徑、Zeta電位，HPLC法測定載藥量，熒光探針法測定臨界膠束濃度，用動態膜透析法測定其在人工胃液和腸液中的體外釋放情況。結果 電鏡照片顯示，他克莫司口服膠束圓整均勻、不粘連，粒徑為(55.77±2.23)nm，Zeta電位為(-6.38±0.47)mV，載藥量為8.93%±0.20%，臨界膠束濃度為2.65×10-3mol/L。體外釋放結果顯示，他克莫司F127-CS/DCA膠束在人工腸液中的釋放速率高于人工胃液。結論 F127-CS/DCA口服膠束具有較高的載藥量和pH依賴釋放特性，適合作為他克莫司口服給藥系統。

他克莫司；復合物膠束；普朗尼克F127-殼聚糖；制備工藝；體外實驗

他克莫司(FK506)作為第2代免疫抑制劑廣泛用于抗移植排斥[1]，因其具有不溶于水的性質，嚴重限制了其胃腸道吸收，口服吸收個體差異很大。口服FK506膠囊劑，肝移植患者平均生物利用度(F)約22%、腎移植患者約20%、健康志愿者僅15%。FK506在血液中與紅細胞、血漿蛋白和淋巴細胞的結合率分別為85%、14%、0.5%[2]。因此，克服其水溶性低、增加口服吸收是一個重要課題。膠束是近年來給藥系統領域研究的一個熱點，特別是聚電解質復合物膠束。它是由帶電的親水共聚物與帶相反電荷的疏水化合物通過正負電結合形成的納米制劑。其中疏水鏈構成內核，疏水性藥物可包裹到膠束內核中，增加其在水中的溶解度[3]。脫氧膽酸鈉(DCA)是膽酸鹽的一種,對疏水性藥物能起到增溶效果[4]。普朗尼克F127(F127)是兩親性嵌段共聚物，因其特有的生物相溶性，已獲FDA批準作為藥用輔料[5]。殼聚糖(CS)是幾丁質的脫乙酰產物。作為自然界存在的惟一一種堿性多糖，其具有安全性、可微生物降解性、生物相容性等特點，加之其來源廣泛及CS衍生物制備簡單，使其作為藥物緩控釋材料得到廣泛研究[6]。2015年3～12月，我們制備帶正電荷的F127-CS聚合物[7]，與DCA通過正負電結合，將疏水藥物FK506包裹，制備膠束；并利用均勻設計優化工藝，對其各項理化性質和體外釋放特征進行了觀察。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 RG-18磁力攪拌器(上海瑪尼儀器設備有限公司)；AV400核磁共振譜儀(Bruker公司, 瑞士)；傅立葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)； FD1A-50 冷凍干燥機(上海豫明冷凍干燥機廠)。F127(BASF公司，美國)；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC，Sigma-Aldrich公司，美國)；丁二酸酐 (上海化學試劑公司產品)；二甲亞砜、三乙胺(上海統亞化工科技發展有限公司)；CS(Mw≤3 000 Da，浙江金殼生物技術有限公司)；其他試劑均購自濟南化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 F127-CS聚合物的制備[7]取3.810 g純化后的F127、0.045 g丁二酸酐、0.055 g二甲基氨基吡啶(DMAP)及0.060 g三乙胺，溶于1,4-二氧六環30 mL中，25 ℃下攪拌后避光反應24 h。圓底燒瓶收集反應后溶液，旋轉蒸發除去有機溶劑，沉淀物用過量乙醚洗滌(重復3次)，25 ℃下真空干燥12 h，即得F127-COOH。將F127-COOH溶于PBS(pH 5)30 mL中，先加入0.087 g EDC，然后按照順序加入0.052 g N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、1.35 g CS，25 ℃下攪拌后避光反應24 h。反應所得裝入透析袋(Mw=6 000～10 000 Da)，室溫重蒸水透析24 h，凍干，即得到F127-CS聚合物。所得產物結構通過紅外光譜和1H-NMR光譜驗證。

1.2.2 F127-CS/DCA載藥膠束的制備 采用透析法制備[8,9]。稱取15 mg DCA、8 mg FK506和15 mg F127-CS聚合物溶于適量甲醇中，裝入透析袋中。用pH 6.5的蒸餾水透析24 h， 以3 000 r/min 離心30 min后，取上清液即得F127-CS/DCA膠束溶液[3]。

1.2.3 載藥量和包封率測定 根據文獻報道采用HPLC法測定膠束載藥量[10]。儀器：Agilent高效液相色譜儀；色譜柱：ODS(DiamonsilTMC18,250 mm ×4.6 mm)；流動相：乙腈∶水∶H3PO4=70∶30∶0.1(V/V/V)；流速1.0 mL/min；柱溫60 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。峰面積(A)與濃度(C)關系的標準曲線為C=0.000 32A-0.025 (R2=0.998 7)。將10 mg F127-CS/DCA FK506大分子復合物膠束溶液加于小試管中，用移液槍精密加入一定體積乙腈渦旋破解，超聲完全溶解，微孔濾膜(0.22 μm)過濾；HPLC法測定，利用標準曲線計算FK506的濃度，進而計算出載藥量和包封率。載藥量=測量所得膠束內藥物量/(載體材料量+測量所得藥物量)×100%；包封率=膠束包裹的藥物量/投藥總量×100%。

1.2.4 F127-CS/DCA膠束制備工藝的優化 采用均勻設計-效應面法優化制備工藝。選擇F127-CS/DCA質量比(X1)、FK506投藥量(X2)、透析樣品體積(X3)、透析液溫度(X4)以及透析時間(X5)進行優化篩選。每個因素選取4個水平，每個水平重復3次。按均勻設計U9(34)表安排實驗，見表1。最優處方的驗證：以載藥量、粒徑、Zeta電位為指標，制備3批F127-CS/DCA載藥膠束，分別對其進行考察。

表1 基于均勻設計的實驗安排表

1.2.5 膠束外觀形態觀察 將膠束滴于電鏡銅網上，1.5%的磷鎢酸負染，透射電鏡觀察形態。

1.2.6 膠束的粒徑分布及Zeta電位測定 采用激光粒度分布儀測定粒徑大小及Zeta電位。

1.2.7 臨界膠束濃度(CMC)測定 根據文獻采用熒光探針法測定CMC[11,12]。將適量芘丙酮溶液轉移到一系列刻度管中，氮氣揮干。將系列不同濃度的空白膠束溶液加入到含芘丙酮的刻度管中，使芘丙酮的最終濃度為2.0×10-6mol/L，搖勻，室溫下平衡過夜。在激發光波長334 nm、發射光波長350～500 nm下測定熒光光譜，繪制發射圖譜第1峰與第3峰的比例隨聚合物濃度的變化曲線，從曲線拐點求CMC。

1.2.8 體外釋放行為觀察 采用膜透析法[13,14]。所用釋放介質是含1%吐溫-80的人工胃液和人工腸液，依據中國藥典2015版第二部配制釋放介質。分別吸取1.5 mL(含藥500 μg)FK506注射劑，DCA膠束溶液及F127-CS/DCA膠束溶液置于夾緊一端的截留分子量為3 500 Da的透析袋中，小心排出氣泡；夾緊另一端，放入50 mL含1%吐溫-80的人工胃液(pH 1.2)及人工腸液(pH 6.8)中，100 r/min 37 ℃恒溫水浴振蕩。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h取樣2 mL，并補加等量溫度相同的介質。采用HPLC法測定，依據公式[13,14]計算累計釋放百分率，繪制釋放曲線。

2 結果

2.1 F127-CS驗證結果 紅外光譜示，F127-CS聚合物出現了一個羰基伸縮振動峰，而F127和CS沒有此峰,表明CS以酰氨鍵與F127連接[15]。F127-CS聚合物的1H-NMR光譜圖中有F127、CS的特征峰，說明F127與CS成功聯接。

2.2 F127-CS/DCA膠束制備工藝最優處方驗證結果 均勻設計實驗結果見表2。根據實驗數據,選擇載藥量為指標，對各因素各水平進行二項式回歸，確定F127-CS/DCA FK506大分子復合物膠束制備的最優處方為X1=1∶1、X2=8 mg、X3=25 ℃、X4=8 mL、X5=15 h。為驗證最優處方的準確性和重復性，制備3批載藥膠束，測定其載藥量、粒徑及Zeta電位，其預期結果分別為8.65%、56.40 nm、-6.54 mV，實際測量結果為8.93%±0.20%、(55.77±2.23)nm、(-6.38±0.47)mV。

2.3 膠束的外觀形態、粒徑、CMC 透射電鏡照片可見，F127-CS/DCA膠束圓整均勻，成形良好，少有粘連，粒徑為(55.77±2.23)nm。空白F127-CS/DCA膠束和空白DCA膠束的CMC分別在2.65×10-3mol/L和1.8×10-2mol/L。空白F127-CS/DCA膠束CMC顯著降低，說明引入合成的F127-CS后，膠束的穩定性得到較好提升，具備更優良的抗體液稀釋能力。

表2 均勻設計實驗結果

2.4 體外釋放行為 在兩種釋放介質中，FK506注射液以近乎勻速緩慢釋放，12 h累計釋放量均不足40%；而F127-CS/DCA膠束和DCA膠束表現出先快后慢的釋放特性。其中，在人工胃液中，F127-CS/DCA膠束的釋放比在人工腸液中釋放的慢，12 h累計釋放量分別為58.74%±2.52%和81.73%±3.25%。見圖1。

圖1 F127-CS/DCA膠束(■)、DCA膠束(◆)及FK506注射液(▲)在人工胃液(A)及人工腸液(B)中體外釋藥曲線

3 討論

FK506是第二代免疫抑制劑中應用較為廣泛的抗移植排斥藥物。FK506具有不溶于水的性質，嚴重限制了其胃腸道吸收，且口服吸收有很大的個體差異。因此，提高溶解度是提高FK506口服制劑生物利用度的關鍵所在。

DCA是膽酸鹽的一種，對疏水性物質起到增溶作用。但是，單純的DCA膠束由于其剛性結構限制其聚集在一起，因此載藥量很低，不能滿足臨床要求。同時這也導致DCA膠束在體液中不穩定，容易被稀釋后分解。因此，本實驗首先合成帶正電荷的F127-CS聚合物，再通過正負電荷的吸引作用與DCA結合，使DCA聚集成膠束。以FK506為模型藥物，制備載藥的膠束。

同時對膠束的理化性質進行研究。結果表明，F127-CS/DCA膠束載藥量約為8.93%；F127-CS/DCA膠束和DCA膠束的CMC分別為2.65×10-3mol/L和1.8×10-2mol/L，F127-CS/DCA膠束體系的穩定性比DCA增大。

體外釋放試驗在DCA載藥膠束、F127-CS/DCA載藥膠束及FK506注射液組3種不同制劑之間對照進行，分別考察它們在人工胃液和人工腸液2種模擬人工介質中的釋放情況。結果表明，相比FK506注射液，2種載藥膠束制劑釋放速度均先快后慢，顯示出一定的緩釋效果;而F127-CS/DCA載藥膠束在2種模擬介質中的釋放速度略有不同，這是由于聚電解質復合物膠束的形成及解聚受環境pH影響較大所致。原因可能是由于在弱堿性條件下，F127-CS/DCA膠束體系中的殼聚糖去質子化，顯中性;導致與帶負電的DCA結合力減弱，膠束解體，FK506釋放,表現出一定程度的pH依賴釋放特性。而DCA膠束的釋放與此相反。

總之，F127-CS/DCA復合物膠束能夠有效荷載疏水性藥物，使藥物在體液中免受消化酶、吞噬系統、pH等的影響，能有效運送藥物到達吸收部位，釋放藥物，促進藥物吸收，是一種比較好的口服給藥系統。

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Preparation of Tacrolimus-loaded polyion complex micelles and their release characteristics in vitro

JIAOYan1,LILingbing,MUYan,XUWei

(1SchoolofPharmacy,ShandongUniversity,Jinan250012,China)

Objective To prepare the Tacrolimus-loaded polyion complex micelles and observe their release characteristics in vitro.Methods Tacrolimus-loaded polyion complex micelles were prepared by film-ultrasonic method with Pluronic F127-chitosan (F127-CS) polymer and sodium deoxycholate (DCA). Preparation technique and optimal formulation were selected via single factor investigation and uniform design. Morphology of polyion micelles was observed by transmission electron microscope. Diameter distribution and zeta potential of polyion micelles were measured by using laser size scattering determinator. Drug loading capacity (DL%) was determined with the high performance liquid chromatography (HPLC). Pyrene as a fluorescence probe was used to detect critical micelle concentration (CMC). In vitro release was evaluated with dynamic membrane dialysis.Results The electron microscope showed spherical micelles were round and uniform. The average diameter was (55.77±2.23) nm, zeta potential was (-6.38±0.47) mV, drug loading capacity (DL%) was 8.93%±0.20%, and the Critical Micelle Concentration (CMC) was 2.65×10-3mol/L.In vitro release study suggested that Tacrolimus-loaded F127-CS/DCA micelles showed a pH-dependent release, the release rate in artificial intestinal juice was higher than that in artificial gastric juice. Conclusion F127-CS/DCA polyion micelles have high drug-loading capacity and pH-dependent release characteristics, and are suitable for oral administration of Tacrolimus.

Tacrolimus; polyion complex micelles; Pluronic F127-chitosan; preparation technique; in vitro experiment

國家自然科學基金青年基金項目(81503261)；山東省自然科學基金青年基金項目(ZR2013HQ011)；山東省濟南市科技明星計劃項目(201406016)。

焦艷(1990-)，女，碩士，主要研究方向為納米給藥系統。E-mail： 137038232@qq.com

簡介： 徐巍(1982-)，男，副主任藥師，主要研究方向為藥物新劑型。E-mail： 13964016747@126.com

牟燕(1971-)，女，副主任藥師，主要研究方向為藥物新劑型。E-mail： yjkmy@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.008

R944.9

A

1002-266X(2016)42-0028-04

2015-06-30)