皮膚再生醫(yī)療技術(shù)對(duì)大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α和IL-6水平的影響

莫小強(qiáng)，金萌,，唐乾利，吳標(biāo)良，黃欣，何曉微，李輝,，曾鴻孟,，王澍

(1右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

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皮膚再生醫(yī)療技術(shù)對(duì)大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α和IL-6水平的影響

莫小強(qiáng)1，金萌1,2，唐乾利1，吳標(biāo)良1，黃欣3，何曉微2，李輝1,2，曾鴻孟1,2，王澍1

(1右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

目的 觀察皮膚再生醫(yī)療技術(shù)(MEBT/MEBO)對(duì)大鼠慢性難愈合皮膚創(chuàng)面組織勻漿中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)水平的影響。方法 將54只慢性難愈合創(chuàng)面模型SD大鼠隨機(jī)分為觀察組、貝復(fù)濟(jì)組、模型組各18只，造模成功后以濕潤(rùn)暴露療法(MEBT)創(chuàng)面分別貼兩層濕潤(rùn)燒傷膏(MEBO)紗條、貝復(fù)濟(jì)浸透紗布、生理鹽水紗布；空白組建立全層皮膚缺損模型，不加任何干預(yù)措施。造模后第3、7、14天各組隨機(jī)處死5只大鼠，取相同部位皮膚潰瘍創(chuàng)面肉芽組織，采用HE染色觀察創(chuàng)面組織病理，ELISA法檢測(cè)創(chuàng)面組織勻漿中的TNF-α、IL-6水平。結(jié)果 造模后第14天，觀察組、貝復(fù)濟(jì)組大鼠創(chuàng)面組織中大量微血管生成，炎癥細(xì)胞消失，創(chuàng)面恢復(fù)良好。各組大鼠創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，但以觀察組下降最明顯，模型組下降最緩慢；觀察組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平始終高于空白組(P均<0.01)；且造模后第7天，觀察組創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平低于貝復(fù)濟(jì)組(P均<0.01)；造模后第14天，觀察組與貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹥0.05)。結(jié)論 MEBT/MEBO可以合理控制炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放，改變病理炎癥反應(yīng)狀態(tài)，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

慢性難愈合創(chuàng)面；皮膚再生醫(yī)療技術(shù)；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素6

Effect of MEBT/MEBO on expression of TNF-α and IL-6 in tissue homogenate of chronic non-healing skin wound in rats

慢性難愈合創(chuàng)面是一種由多因素引起的經(jīng)1個(gè)月以上治療未能愈合，也無(wú)愈合傾向或經(jīng)常復(fù)發(fā)的常見(jiàn)外科疾病[1]，且慢性皮膚潰瘍久治不愈存在癌變風(fēng)險(xiǎn)[2]。有研究[3]表明，失控性炎癥反應(yīng)狀態(tài)是慢性難愈合創(chuàng)面產(chǎn)生的可能機(jī)制。皮膚再生醫(yī)療技術(shù)是以濕潤(rùn)燒傷膏(MEBO)為治療藥物，以濕潤(rùn)暴露療法(MEBT)為治療原則，以啟動(dòng)自身潛能再生細(xì)胞原位干細(xì)胞培植皮膚為技術(shù)核心的一項(xiàng)新技術(shù)，簡(jiǎn)稱(chēng)MEBT/MEBO。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， MEBT/MEBO可加速創(chuàng)面愈合的進(jìn)程，縮短愈合時(shí)間，減少瘢痕組織增生[4～9]。2015年10～12月，我們動(dòng)態(tài)觀察了大鼠慢性難愈合模型創(chuàng)面肉芽組織病理結(jié)構(gòu)及其促炎因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)變化，以探討MEBT/MEBO促進(jìn)大鼠慢性難愈合創(chuàng)面愈合的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年SPF級(jí)SD雄性大鼠80只，12周齡，體質(zhì)量220～250 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按照相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例處置實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在20～25 ℃、濕度55%～75%、通風(fēng)良好的SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。主要藥品、試劑：MEBO，北京光明中醫(yī)燒傷創(chuàng)瘍研究所汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)美寶制藥廠提供，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000004，規(guī)格：40 g/支；貝復(fù)濟(jì)(外用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，rb-bFGF)，珠海億勝生物制藥有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字S19991021，規(guī)格：5 g/支；水合氯醛，泰興市豪申化工貿(mào)易有限公司提供，CAS：302-17-0，規(guī)格：250 g/瓶；醋酸氫化可的松注射液，上海通用藥業(yè)股份有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字H31021290，規(guī)格：125 mg/支；ELISA大鼠TNF-α、IL-6試劑盒，卡邁舒生物科技有限公司提供，目錄號(hào)：EK-R31161。實(shí)驗(yàn)儀器：組織勻漿器(UP200H)；1-14K型高速冷凍離心機(jī) (SIGMR)；酶標(biāo)儀(Labsystems Multiskan MS352型)；Research 系列移液槍(Eppendorf)；漩渦混合器(Vortex gene)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與造模 80只大鼠中隨機(jī)選取20只作為空白組，建立全層皮膚缺損模型[10]，不加任何干預(yù)措施；其余60只參照全層皮膚缺損法和沈氏改良塑料環(huán)肉芽腫定量法[11]經(jīng)改進(jìn)制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。將大鼠用7%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，造模區(qū)(腰椎正中偏上)備皮，用直徑15 mm的圖章標(biāo)記造模面積；在無(wú)菌條件下，沿脊椎方向用外科方法做2條深達(dá)筋膜、直徑為15 mm的全層皮膚缺損圓形創(chuàng)面；造模后即刻注射醋酸氫化可的松(8 mg/100 g)，建成慢性難愈合創(chuàng)面模型。造模后第2天死亡6只，將剩余大鼠隨機(jī)分為模型組、觀察組、貝復(fù)濟(jì)組各18只。

1.2.2 換藥方法 造模次日開(kāi)始換藥，僅換藥首日先以1/5 000 呋喃西林液清潔創(chuàng)面，之后每日換藥2次。觀察組創(chuàng)面貼兩層按照《燒傷皮膚再生醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用規(guī)范》[12]制作的MEBO 紗條(0.2 g/cm2)，貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面貼兩層貝復(fù)濟(jì)浸透紗布(60 U/cm2)，模型組創(chuàng)面敷兩層生理鹽水紗布，空白組不處理。各組創(chuàng)面外層均用滅菌干紗布覆蓋，并以膠帶固定。

1.2.3 標(biāo)本采集 造模后，各組于造模第3、7、14天3個(gè)時(shí)點(diǎn)隨機(jī)取5只大鼠創(chuàng)面相同部位全層皮膚肉芽組織，深達(dá)筋膜層。其中一側(cè)創(chuàng)面組織用4%甲醛溶液浸泡固定做病理切片，另一側(cè)及時(shí)放-80 ℃超低溫冰箱保存；待3個(gè)時(shí)點(diǎn)統(tǒng)一收集完標(biāo)本，行后續(xù)相關(guān)檢查。

1.2.4 創(chuàng)面組織病理觀察 取創(chuàng)面組織，常規(guī)HE染色，鏡下觀察肉芽組織病理變化。

1.2.5 創(chuàng)面組織TNF-α、IL-6檢測(cè) 取創(chuàng)面組織，制作組織勻漿，采用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6水平，按試劑盒操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面組織病理檢查結(jié)果 ①造模后第3天：空白組創(chuàng)面組織有結(jié)痂、出血，呈灶性水腫，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞較少；觀察組創(chuàng)面組織有出血，輕度水腫，肉芽組織呈層狀分布，也見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞呈散在分布，小血管排列致密，走向紊亂；貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織有出血，肉芽也為層狀分布，層與層之間有水腫，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和散在成纖維細(xì)胞分布，可見(jiàn)新生血管，排列較紊亂；模型組創(chuàng)面組織表層有結(jié)痂、出血，高度水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，散在成纖維細(xì)胞分布。②造模后第7天：空白組創(chuàng)面組織炎癥細(xì)胞減少，新生血管比較密集，血管排列整齊，成纖維細(xì)胞增多；觀察組創(chuàng)面無(wú)水腫，炎癥細(xì)胞較不明顯，肉芽組織比較成熟，血管之間有致密的纖維束，排列相對(duì)紊亂，存在大量成纖維細(xì)胞密集分布；貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面無(wú)水腫，炎癥細(xì)胞已經(jīng)基本不見(jiàn)，但可見(jiàn)新生微血管、成纖維細(xì)胞增多；模型組創(chuàng)面則可見(jiàn)較多的炎癥細(xì)胞，成纖維細(xì)胞數(shù)量少且排列較稀疏，新生血管較稀少，且排列紊亂。③造模后第14天：空白組創(chuàng)面組織中可見(jiàn)大量微血管生成，且排列整齊，可見(jiàn)皮膚結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器生長(zhǎng)旺盛；觀察組創(chuàng)面組織中大量微血管生成，排列較整齊，炎癥細(xì)胞消失，可見(jiàn)類(lèi)似脂肪樣組織；貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織可見(jiàn)生成大量微血管分布，無(wú)炎癥細(xì)胞聚集，有少量脂肪空泡；模型組創(chuàng)面組織中仍分布有大量炎癥細(xì)胞，微血管生成較少，肉芽組織結(jié)構(gòu)較疏松，部分創(chuàng)面出現(xiàn)上皮化，但毛囊、皮脂腺少。

2.2 各組大鼠創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平比較 各組大鼠創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平隨造模時(shí)間延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，但以觀察組下降最明顯，模型組下降最緩慢；觀察組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平始終高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；且造模后第7天，觀察組創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平低于貝復(fù)濟(jì)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；造模后第14天，觀察組與貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均﹥0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平比較

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01；與觀察組比較，▲P<0.01。

3 討論

創(chuàng)面愈合是一個(gè)由炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)多因素共同參與其中，各自發(fā)揮作用的復(fù)雜的生物動(dòng)力學(xué)過(guò)程。其中調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化作用的細(xì)胞因子，在細(xì)胞趨化及增殖、血管新生、膠原合成等創(chuàng)面愈合環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要作用[13]。TNF-α、IL-6是促使炎癥反應(yīng)最活躍的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能使更多的免疫細(xì)胞、生長(zhǎng)因子匯集到炎癥部位，在機(jī)體修復(fù)和生存過(guò)程中起到十分重要的作用[14]。在炎癥應(yīng)答過(guò)程中，TNF-α既是促炎細(xì)胞因子，也是引起感染性疾病的重要炎癥介質(zhì)；它可以誘導(dǎo)激活I(lǐng)L-6炎性細(xì)胞因子的生成和表達(dá)，激發(fā)連鎖的炎癥反應(yīng)[15]。IL-6與其受體結(jié)合，借助MAPK通路轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)促進(jìn)炎癥細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)，使中性粒細(xì)胞的活化和聚集能力增強(qiáng)，可作為判斷機(jī)體炎癥與組織損傷嚴(yán)重程度的靈敏可靠指標(biāo)，其表達(dá)與創(chuàng)傷程度呈正相關(guān)[16]。

MEBT/MEBO是將燒傷組織置于生理濕潤(rùn)環(huán)境下，MEBO與燒傷、創(chuàng)面組織發(fā)生水解、酶解、酸敗與皂化等反應(yīng)，無(wú)損傷性液化方式排除創(chuàng)面壞死組織，通過(guò)MEBT/MEBO激活皮膚自身潛能再生細(xì)胞(再生信息組織)，實(shí)現(xiàn)原位培植皮膚組織。由于MEBO的主要藥物為黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼等，藥物中含有β-谷甾醇、小檗堿等多種抑制炎癥、抗菌的成分，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為有活血化瘀、清熱解毒、祛腐生肌的功效。MEBT/MEBO不僅能最大限度地為創(chuàng)面提供一種生理環(huán)境，使創(chuàng)面中的壞死組織呈液態(tài)化排出，MEBO中所含營(yíng)養(yǎng)成分又能給殘余組織中干細(xì)胞的生命活動(dòng)提供充足的能量與動(dòng)力，最終使創(chuàng)面能在生理層面原位再生[17]。該項(xiàng)技術(shù)已逐步發(fā)展成為以原位干細(xì)胞培植皮膚技術(shù)為基礎(chǔ)的獨(dú)具特色的燒傷及慢性創(chuàng)面修復(fù)醫(yī)療技術(shù)。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)組織病理學(xué)觀察我們發(fā)現(xiàn)MEBT/MEBO能明顯改善損傷創(chuàng)面的細(xì)胞代謝。在造模第3天時(shí)，4組大鼠均有出血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等情況出現(xiàn)。至第7天時(shí)，觀察組、貝復(fù)濟(jì)組大鼠創(chuàng)面水腫消失，炎癥細(xì)胞明顯減少。第14天時(shí)，觀察組、貝復(fù)濟(jì)組大鼠創(chuàng)面與造模第3天時(shí)相比明顯好轉(zhuǎn)；尤其是觀察組大鼠可觀察到大量新生血管分布于視野當(dāng)中，成纖維細(xì)胞分布密集，同時(shí)毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器生長(zhǎng)旺盛明顯。這說(shuō)明MEBO能減少炎癥細(xì)胞，加速成纖維細(xì)胞生成，促進(jìn)新生血管形成，防止組織進(jìn)一步損傷。我們還觀察到，創(chuàng)面組織中勻漿中TNF-α與IL-6水平變化一致。各組大鼠創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，但以觀察組下降最明顯，模型組下降最緩慢，說(shuō)明炎癥狀態(tài)與受傷時(shí)間有一定相關(guān)性。觀察組、貝復(fù)濟(jì)組創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平始終高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模后第7天，觀察組創(chuàng)面組織勻漿中TNF-α、IL-6水平低于貝復(fù)濟(jì)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在治療中期觀察組創(chuàng)面修復(fù)情況優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)組，兩者均能活化TNF-α調(diào)節(jié)免疫、增加成纖維細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)下調(diào)IL-6增強(qiáng)機(jī)體的防御能力[18]。造模后第14天，觀察組、貝復(fù)濟(jì)組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在創(chuàng)面修復(fù)后期，MEBO、貝復(fù)濟(jì)均能改善創(chuàng)面微環(huán)境，但療效上無(wú)明顯差異。

綜上所述，我們認(rèn)為模型組創(chuàng)面愈合緩慢可能與TNF-α和IL-6過(guò)度高表達(dá)有關(guān)，MEBO、貝復(fù)濟(jì)兩種藥物干預(yù)均可以降低TNF-α、IL-6的過(guò)表達(dá)，尤其在治療第7天時(shí)MEBO的作用更為明顯。因此，在慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，MEBT/MEBO可合理控制炎癥因子的釋放，清除壞死組織、控制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)平穩(wěn)的炎性信號(hào)刺激，從而能為創(chuàng)面組織細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)良好的增生生理環(huán)境，加快創(chuàng)面愈合。

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MOXiaoqiang1,JINMeng,TANGQianli,WUBiaoliang,HUANGXin,HEXiaowei,

LIHui,ZENGHongmeng,WANGShu

(1YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)

Objective To investigate the effects mechanism of skin regeneration medical technique (Moist expose burn therapy/Moist expose burn ointment, MEBT/ MEBO) on TNF-α and IL-6 in the granulation tissues in the chronic non-healing skin wounds of rats. Methods Fifty-four SD rats were randomly divided into the observation group, rb-BFGF group and model group. After making the successful models of skin ulcer, the rats in the above groups were respectively posted with two layers of MEBO gauze, bFGF impregnated gauze, and saline gauze. In the blank group, we established models with full-thickness skin defect, without any intervention. Five rats were randomly chosen and killed separately 3, 7 and 14 days in every group after the modeling. The granulation tissues in the same part of the skin ulcer wound were obtained and the histological structures were detected by HE staining. TNF-α and IL-6 expression was examined by ELISA technique. Results A large amount of micro angiogenesis generated in rats of the observation group and rb-BFGF group 14 days after the treatment. Besides, the inflammation cells disappeared and the skin wounds recovered well. The content of TNF-α and IL-6 was gradually decreased in all groups, the decline in the observation group was the most obvious. During the modeling, the expression of TNF-α and IL-6 in the observation group and rb-BFGF group was always higher than that in the blank group and the difference was statistically significant (allP<0.01). Seven days after modeling, the expression of TNF-α and IL-6 in the observation group was lower than that in the rb-BFGF group and the difference is statistically significant (P<0.01). Conclusion MEBT/ MEBO could control the release of TNF-α and IL-6, change the pathological state of inflammation so as to promote the wound healing.

chronic non-healing skin wound; skin regeneration medical technique; tumor necrosis factor-α; interleukin-6

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560776，81360547)；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014GXNSFAA118135)。

莫小強(qiáng)(1979-)，碩士，講師，主要研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作。E-mail: xiaoqiangmo@sina.com

簡(jiǎn)介：唐乾利(1961-)，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合外科學(xué)、創(chuàng)面修復(fù)等。E-mail： htmgx@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.007

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1002-266X(2016)42-0024-04

2016-06-20)