GLI3基因表達(dá)與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病的關(guān)系

程國(guó)杰，呂發(fā)明，王晶，艾克巴爾·阿不都熱西提，董豪杰

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊830000)

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GLI3基因表達(dá)與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病的關(guān)系

程國(guó)杰，呂發(fā)明，王晶，艾克巴爾·阿不都熱西提，董豪杰

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊830000)

目的 探討GLI3基因表達(dá)與新疆維吾爾族先天性馬蹄內(nèi)翻足(ICTEV)發(fā)病之間的關(guān)系。方法 選擇新疆地區(qū)84例ICTEV患兒(維吾爾族51例，漢族33例)和39例足部創(chuàng)傷正常兒童(維吾爾族25例，漢族14例)，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot法檢測(cè)足部肌肉組織中的GLI3 mRNA及蛋白。結(jié)果 觀察組足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.61±0.02、68.72±3.05，對(duì)照組分別為0.07±0.01、22.38±1.74，P均<0.01；觀察組維吾爾族患兒足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.73±0.01、83.01±4.42，漢族患兒分別為0.40±0.02、56.85±3.50，P均<0.05；對(duì)照組維吾爾族和漢族患兒足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，P均>0.05。結(jié)論 GLI3基因表達(dá)與新疆維吾爾族ICTEV的發(fā)病有一定關(guān)系，維吾爾族可能更易受GLI3基因表達(dá)水平的影響而導(dǎo)致ICTEV的發(fā)生。

先天性馬蹄內(nèi)翻足；GLI3基因；維吾爾族；漢族；發(fā)病關(guān)系；新疆;兒童

先天性馬蹄內(nèi)翻足(ICTEV)是一種常見的嚴(yán)重影響兒童足功能的先天畸形之一，發(fā)病率為1%～8%[1]，目前該病的致病原因尚不明確。相關(guān)研究表明，遺傳、血管發(fā)育異常和多細(xì)胞因子相互作用等因素在ICTEV發(fā)病過(guò)程的起到重要作用[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，不同民族間ICTEV發(fā)病率存在明顯差異，我國(guó)維吾爾族ICTEV患病率明顯高于本地區(qū)其他民族[3]。因此，在排除氣候、環(huán)境、生活方式等方面的影響之外，應(yīng)注意因遺傳和多細(xì)胞因子平衡作用所致的民族間ICTEV發(fā)病率差異[4～6]。SHH-GLI信號(hào)通路是胚胎發(fā)育過(guò)程中重要信號(hào)通路之一，在正常肢體發(fā)育方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。GLI3基因作為GLI基因家族成員，其與SHH相互制約、相互平衡確保肢體的正常形態(tài)。2005年，Johnston等[8]證實(shí)GLI3基因突變是導(dǎo)致多指(趾)綜合征的原因之一。因此，選擇人體先天性肢體缺陷影響因子GLI3，以及與其他民族ICTEV發(fā)病率存在明顯差異的維吾爾族作為發(fā)病關(guān)系的研究對(duì)象，是了解維吾爾族ICTEV高發(fā)病率成因，以及進(jìn)一步探索ICTEV致病原因的有效方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年2月～2015年11月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)傷骨科收治的84例ICTEV患兒(觀察組)，其中男56例、女28例，年齡(6.45±2.11)歲；維吾爾族51例，漢族33例；均符合《骨科診療常規(guī)》中ICTEV的診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)中收集患兒足部肌肉組織。選擇新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院和喀什人民醫(yī)院收治的足部創(chuàng)傷患兒39例(對(duì)照組)，其中男22例、女17例，年齡(7.11±2.10)歲；維吾爾族25例，漢族14例；均無(wú)其他疾病，術(shù)中收集患兒足部肌肉組織。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，患兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書。兩組患兒性別、年齡及民族構(gòu)成均具有可比性(P均>0.05)。

1.2 足部肌肉組織中GLI3基因檢測(cè)方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。以TRIzol試劑盒提取ICTEV患兒和正常兒童足部肌肉組織的總RNA，運(yùn)用Invitrogen公司MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-70 ℃冷凍保存。按照Invitrogen公司Platinum SYBR Green qPCR Super Mix Kit使用說(shuō)明書操作。GLI3 mRNA上游引物為5′-TTTTCCAACACAGAGGCCTATTC-3′，下游引物為5′-ATCTTGGACCTCTTGTTGTGCAT-3′，擴(kuò)增片段153 bp；β-actin上游引物為5′-TCACCCACACTGCCCATCTACGA-3′，下游引物為5′- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′，擴(kuò)增片段205 bp；引物均有上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系(25 μL)：SYBR Green Realtime PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA樣品2 μL，去離子水8.5 μL；反應(yīng)條件:95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；56 ℃退火無(wú)延伸步驟。記錄各擴(kuò)增反應(yīng)Ct值，mRNA相對(duì)表達(dá)量2-ΔCt=CT目的基因-CT看家基因，計(jì)算GLI3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 足部肌肉組織中GLI3蛋白檢測(cè)方法 采用Western blot法。提取ICTEV患兒和正常兒童足部肌肉組織蛋白，采用Bradford法測(cè)定總蛋白量。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)入PVDF膜進(jìn)行封閉。封閉結(jié)束后，用1∶300稀釋的鼠抗人GLI3抗體和鼠抗人β-actin抗體室溫雜交1 h，1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠(二抗)室溫孵育1 h。條帶經(jīng)Odyssey紅外線熒光掃描儀掃描后，采用Image-Pro Plus圖像軟件進(jìn)行分析。以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的光密度比值，表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見表1。

表1 兩組足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2 維吾爾族與漢族患兒足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見表2。

表2 維吾爾族與漢族患兒足部肌肉組織中GLI3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與同組漢族比較，*P<0.05。

3 討論

ICTEV是一種常見的骨科出生缺陷，嚴(yán)重威脅兒童的身體和心理健康。近年新疆地區(qū)ICTEV發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，喀什、和田等南疆地區(qū)維吾爾族ICTEV發(fā)病率明顯高于新疆其他民族和全國(guó)發(fā)病水平。當(dāng)?shù)豂CTEV流行病學(xué)調(diào)查提示，骨骼發(fā)育異常、血管發(fā)育異常、遺傳因素、母親吸煙史和多種細(xì)胞因子的相互作用可能是導(dǎo)致ICTEV發(fā)病的主要原因。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，關(guān)于細(xì)胞基因表達(dá)對(duì)ICTEV發(fā)病和畸形程度影響的相關(guān)研究備受關(guān)注。Wang等[9]運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)ICTEV患兒肌肉組織，發(fā)現(xiàn)ICTEV患兒肌肉組織Pitx1、Col2al基因表達(dá)水平明顯下調(diào)，表明兩種基因與ICTEV存在一定關(guān)系。此外，Wang等[10]發(fā)現(xiàn)，ICTEV患兒肌肉組織SOX9基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量明顯高于正常人。推測(cè)在ICTEV的致病過(guò)程中，SOX9基因過(guò)度表達(dá)可能發(fā)揮重要作用。Cao等[11]利用RT-PCR、免疫組化和Western blot法分析大鼠En1基因與ICTEV的相關(guān)性，結(jié)果證實(shí)En1、GLI3基因在ICTEV模型鼠中表達(dá)水平分別下降和上升；通過(guò)P-Match軟件分析提示，在ICTEV模型鼠中，En1基因表達(dá)水平下降可能引起GLI3基因表達(dá)水平上升，最終導(dǎo)致大鼠ICTEV的發(fā)生。

SHH-GLI信號(hào)通路由SHH分泌蛋白啟動(dòng)，在靶細(xì)胞中引發(fā)一系列反應(yīng)，最終與GLI轉(zhuǎn)錄因子家族共同作用導(dǎo)致靶基因的激活或抑制，對(duì)胚胎正常發(fā)育起到至關(guān)重要的作用[12]。相關(guān)研究表明，GLI3作為SHH-GLI信號(hào)通路中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，通過(guò)自身裂解來(lái)抑制SHH靶基因的表達(dá)，而SHH同樣可以抑制GLI3的裂解，達(dá)到SHH-GLI3相互平衡的狀態(tài)，以維持肢體的正常形態(tài)[13,14]；如果機(jī)體一旦失去SHH-GLI的平衡狀態(tài)，將導(dǎo)致多種先天畸形的發(fā)生。例如，在指的發(fā)育中，如果沒(méi)有SHH的作用，GLI3的抑制效應(yīng)占優(yōu)勢(shì)，其靶基因被抑制而出現(xiàn)形態(tài)異常；但除去GLI3，機(jī)體同樣不能維持正常形態(tài)，甚至出現(xiàn)多指現(xiàn)象[7]。此外，GLI3基因的突變同樣可以引起肢體的異常形態(tài)。Johnston等[8]為進(jìn)一步證實(shí)GLI3基因突變可能導(dǎo)致多指(趾)綜合征，對(duì)89例患者進(jìn)行GLI3基因突變檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)47種致病突變，并且GLI3突變多數(shù)是DNA重復(fù)、大片段缺失以及錯(cuò)義、移碼、無(wú)義突變。而本研究表明，ICTEV患兒足部肌肉組織中GLI3基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)明顯上調(diào)，除了進(jìn)一步揭示GLI3基因表達(dá)與ICTEV的發(fā)生存在關(guān)系，還可以推斷ICTEV的發(fā)生可能與SHH-GLI信號(hào)通路失去原有的平衡狀態(tài)有關(guān)。

此外，為了進(jìn)一步探討GLI3基因與ICTEV的相關(guān)性，本研究對(duì)維吾爾族、漢族ICTEV患兒以及維吾爾族、漢族正常兒童進(jìn)行GLI3表達(dá)水平的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，維吾爾族ICTEV患兒GLI3基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平上調(diào)程度均高于漢族ICTEV患兒，維吾爾族正常兒童和漢族正常兒童足部肌肉組織中GLI3基因表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示GLI3基因可能在不同民族間ICTEV發(fā)病率差異性方面發(fā)揮著重要作用；并且，維吾爾族可能更容易受GLI3上游信號(hào)通路或SHH-GLI3信號(hào)通路的影響，進(jìn)而引起GLI3基因的異常表達(dá)。

綜上所述，GLI3基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平異常上調(diào)與ICTEV的發(fā)生存在一定的關(guān)系，并且維吾爾族兒童可能更易受GLI3基因異常表達(dá)的影響而出現(xiàn)ICTEV。此外，GLI3基因的突變可能是該基因參與ICTEV致病的一種機(jī)制。因此，仍然需要對(duì)GLI3基因的突變篩查做進(jìn)一步研究，以便深入探討ICTEV的致病原因和新疆維吾爾族ICTEV高發(fā)的成因。

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Pathogenic relation between GLI3 expression and idiopathic congenital talipes equinovarus in Xinjiang Uygur nationality

CHENGGuojie,LYUFaming,WANGJing,AikebareAbudurexiti,DONGHaojie

(TheAffiliatedTraditionalChineseMedicineHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China)

Objective To investigate the pathogenic relation between GLI3 expression and idiopathic congenital talipes equinovarus (ICTEV) in Xinjiang Uygur nationality. Methods Eighty-four cases of children with ICTEV (observation group, 51 cases of Uygur, 22 cases of Han) and 39 cases of children with normal foot trauma (control group, 25 cases of Uygur, 14 cases of Han) were chosen from Xinjiang. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting were used to analyze the mRNA and protein levels of GLI3 gene in the muscular tissues. Results The mRNA and protein levels of GLI3 were 0.61±0.02, 68.72±3.05 in the foot muscular tissues in the observation group, while they were 0.07±0.01 and 22.38±1.74 in the control group, which were significant different (allP<0.01). The mRNA and protein levels of GLI3 in the foot muscular tissues from Uygur children of the observation group were 0.73±0.01 and 83.01±4.42, while they were 0.40±0.02 and 56.85±3.50 in Han, which were statistically different (allP<0.05).There were no significant differences in GLI3 mRNA and protein expression levels between the Uygur and Han children in the control group (allP>0.05). Conclusion There is some correlation between GLI3 gene expression and ICTEV, and the Uygur nationality who is easily affected by expression level of GLI3 gene is easier to get ICTEV.

idiopathic congenital talipes equinovarus; GLI3 gene; Uygur nationality; Han nationality; pathogenic relation; Xinjiang; child

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160215)。

程國(guó)杰(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，副教授，主要研究方向?yàn)槔夏牦y骨骨折圍手術(shù)期治療及肩部創(chuàng)傷中西醫(yī)結(jié)合治療。E-mail: 898649737@qq.com

簡(jiǎn)介：呂發(fā)明(1957-)，男,主任醫(yī)師，教授，主要研究方向?yàn)槁攒浗M織損傷的中西醫(yī)結(jié)合治療。E-mail: king-2032169@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.006

R682.1

A

1002-266X(2016)42-0021-03

2016-07-13)