辛芍組方對缺血再灌注損傷后神經細胞氧化應激及NF-κB信號通路的影響

董永喜，王霞，董莉，劉宗炎，王愛民，蘭燕宇

(1貴州醫科大學藥學院，貴陽550004；2貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室)

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辛芍組方對缺血再灌注損傷后神經細胞氧化應激及NF-κB信號通路的影響

董永喜1,2，王霞1,2，董莉1,2，劉宗炎1,2，王愛民2，蘭燕宇2

(1貴州醫科大學藥學院，貴陽550004；2貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室)

目的 觀察辛芍組方對缺血再灌注損傷后神經細胞的氧化應激反應及核因子κB(NF-κB)信號通路蛋白表達的影響，探討辛芍組方發揮腦保護作用的機制。方法 培養PC12細胞，分為正常對照組、模型組及辛芍組方低、中高劑量組。模型組及辛芍組方各劑量組均以氧糖剝奪/復氧損傷方法建立缺血再灌注損傷模型，造模后辛芍組方低、中、高劑量組分別加入辛芍組方0.31、0.62、1.25 mg/L，均干預4 h。正常對照組及模型組不干預。采用ELISA法檢測各組細胞內超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)，采用Western blot法檢測各組細胞內誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環氧合酶2(COX-2)及NF-κB信號通路相關蛋白IκBα、p-IκBα、p65蛋白表達。結果 與正常對照組比較，模型組細胞內SOD水平降低、MDA水平升高(P均<0.01)。與模型組比較，辛芍組方中、高劑量組細胞內SOD水平均升高(P<0.05或0.01)，辛芍組方各劑量組細胞內MDA水平均降低(P<0.05或0.01)。與正常對照組比較，模型組iNOS、COX-2蛋白表達均升高(P均<0.01)；與模型組比較，辛芍組方各劑量組iNOS、COX-2蛋白表達均降低(P<0.05或0.01)。與正常對照組比較，模型組細胞質p-IκBα/IκBα值及細胞核內p65蛋白表達均增加(P均<0.01)；與模型組比較，辛芍組方各劑量組p-IκBα/IκBα值、p65蛋白表達均降低(P<0.05或0.01)。結論 辛芍組方對缺血再灌注損傷后的PC12細胞具有保護作用，其機制可能與減輕細胞內氧化應激反應、抑制NF-κB通路的活化有關。

缺血再灌注損傷；神經細胞；辛芍組方；中藥；氧化應激；核因子κB；炎癥反應；腦缺血

腦血管病是嚴重威脅人類生命和健康的疾病之一，具有病死率高、致殘率高的特點，給患者家庭及社會造成沉重負擔[1,2]。腦缺血再灌注損傷是指腦血流中斷或大量減少后，在恢復血液灌流后引起腦組織損傷進一步加重的現象。腦缺血再灌注損傷涉及多種機制，包括氧化應激、炎性損傷和細胞凋亡等，其中活性氧所介導的氧化應激反應和核因子-κB(NF-κB) 信號通路激活在腦缺血再灌注損傷中占有重要地位[3]。辛芍組方由燈盞細辛和赤芍配伍組成，用于治療中風、偏癱有較好的臨床效果，但其對腦缺血再灌注損傷的作用及其機制尚不明確。PC12細胞在形態、生理及生化功能方面都接近于神經元，其氧糖剝奪/復氧(OGD/R)損傷細胞模型被廣泛應用于模擬體內腦缺血再灌注損傷[4]。2014年2～6月，我們觀察了辛芍組方對缺血再灌注后神經細胞氧化應激反應及NF-κB信號通路的影響，探討其防治腦缺血再灌注損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 PC12細胞(高分化)購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；辛芍組方由貴州省藥物制劑重點實驗室提供。高糖及無糖DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(德國Biochrom公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；一氧化氮合酶(iNOS)、環氧合酶2(COX-2)、NF-κB信號通路相關蛋白(IκBα、p-IκBα、p65)及內參β-actin、Lamin B抗體(美國Santa Cruz公司)；蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)；ECL免疫印跡化學發光試劑(上海七海復泰生物技術有限公司)；連二亞硫酸鈉(Na2S2O4,上海晶純試劑有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 細胞培養及分組 PC12細胞培養于含10%胎牛血清、5%馬血清、96 mg/L青霉素和160 mg/L鏈霉素的DMEM完全培養基中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞融合至80%時，用0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期細胞，以(3～4)×104/mL細胞密度接種96孔板，孵育24 h；設正常對照組、模型組及辛芍組方低、中、高劑量組，每組設6個復孔。

1.3 模型制備及干預方法 模型組及辛芍組方各劑量組均加入含30 mmol/L Na2S2O4的無糖DMEM培養液100 μL以建立OGD/R損傷細胞模型，正常對照組加入DMEM 100 μL，各組均培養4 h。棄去培養液，更換DMEM培養液(即復氧復糖，模擬再灌注)后，辛芍組方低、中、高劑量組分別加入辛芍組方0.31、0.62、1.25 mg/L，正常對照組及模型組不干預，繼續培養4 h。

1.4 細胞內SOD與MDA檢測 采用ELISA法。取各組細胞，棄培養液；每孔加入1%的裂解液600 μL裂解細胞，按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞內SOD、MDA。

1.5 細胞內iNOS、COX-2及NF-κB信號通路相關蛋白檢測 采用Western blot法。各組干預后，按照蛋白抽提試劑盒說明書分別提取細胞質及細胞核內蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測各待測蛋白的表達。20 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；轉膜及封閉后，各組分別加入iNOS(1∶500)、COX-2(1∶200)、IκBα(1∶10 000)、p-IκBα(1∶10 000)、p65(1∶1 000)、β-actin(1∶3 000)、Lamin B(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜；二抗孵育1.5 h后，ECL發光試劑顯色；凝膠成像系統掃描圖像，通過Gene Tools分析軟件進行目的蛋白灰度值分析。以iNOS、COX-2與β-actin灰度值比值作為iNOS、COX-2蛋白的相對表達量，以p-IκBα與IκBα灰度值比值作為p-IκBα蛋白的相對表達量，以p65與Lamin B灰度值比值作為p65蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

2 結果

2.1 各組細胞內SOD與MDA水平比較 與正常對照組比較，模型組細胞內SOD水平降低、MDA水平升高(P均<0.01)。與模型組比較，辛芍組方中、高劑量組細胞內SOD水平均升高(P<0.05或0.01)，辛芍組方各劑量組細胞內MDA水平均降低(P<0.05或0.01)。見表1。

表1 各組細胞內SOD、MDA水平比較

注：與正常對照組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，▲P<0.01。

2.2 各組細胞內iNOS、COX-2蛋白及NF-κB信號通路相關蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型組iNOS、COX-2蛋白表達均升高(P均<0.01)；與模型組比較，辛芍組方各劑量組iNOS、COX-2蛋白表達均降低(P<0.05或0.01)。與正常對照組比較，模型組細胞質內p-IκBα蛋白表達增加、IκBα蛋白表達降低，且p-IκBα/IκBα值升高(P均<0.01)，細胞核內p65蛋白表達增加(P<0.01)；與模型組比較，辛芍組方各劑量組細胞質內p-IκBα/IκBα值、細胞核內p65蛋白表達均降低(P<0.05或0.01)。見表2。

表2 各組細胞內iNOS、COX-2、p-IκBα/IκBα及p65蛋白表達比較

注：與正常對照組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，▲P<0.01。

3 討論

缺血性腦卒中發生后，缺血后的腦組織恢復血流發生再灌注時，在某些情況下能導致進一步的腦組織損傷和功能障礙，加重原有的病變，這種恢復血流灌注后的損傷情況稱為缺血再灌注損傷。研究表明，腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中加重損傷的主要原因，氧化應激、炎癥反應是腦缺血再灌注后腦損傷的主要機制。目前研究認為，抑制缺血再灌注損傷是治療缺血性腦卒中的關鍵環節[5]。

菊科植物燈盞細辛和毛茛科植物赤芍均為傳統的活血化瘀類中藥。在貴州少數民族地區，常用燈盞細辛和赤芍進行組方配制為辛芍組方，具有活血化瘀、通經活絡功能，臨床用于中風瘀血阻絡證的治療，具有較好的臨床應用效果[6,7]。本課題組前期研究發現，辛芍組方具有抑制大鼠動靜脈旁路血栓形成[6]、延長小鼠凝血時間[6]、抑制H2O2誘導的PC12細胞脂質氧化及活性氧生成[8]等作用，這表明辛芍組方可通過多種途徑發揮對缺血性疾病的防治作用。

氧化應激是導致腦缺血再灌注后組織損傷的重要因素之一。腦缺血再灌注損傷后，由于黃嘌呤氧化酶產生增多、中性粒細胞激活及線粒體內單電子還原等原因，產生大量氧自由基，遠遠超過了內源性抗氧化系統的清除能力,造成細胞氧化應激損傷[9,10]。SOD作為主要的抗氧化酶，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，能夠清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，因此SOD水平可反映機體清除氧自由基的能力。MDA是氧自由基損傷細胞膜結構的最終產物，細胞內MDA水平可反映自由基攻擊細胞后的細胞損傷程度。因此，細胞內SOD及MDA水平常作為評價細胞抗氧化能力的指標[9～12]。本研究發現，模型組細胞內SOD水平低于正常對照組、MDA水平高于正常對照組，提示缺血再灌注可使PC12細胞內SOD水平降低、MDA水平增加，表明PC12細胞受到嚴重的自由基損傷，發生缺血再灌注損傷；辛芍組方中、高劑量組細胞內SOD水平均高于模型組，辛芍組方各劑量組細胞內MDA水平均低于模型組，提示給予辛芍組方后，PC12細胞內SOD水平升高、MDA水平降低，表明辛芍組方通過增強細胞抗氧化能力，從而對缺血再灌注損傷后的細胞發揮保護作用。

炎癥反應在腦缺血再灌注損傷機制中具有重要作用。研究表明，腦缺血后的炎癥反應是造成腦組織損傷的因素之一，其與其他因素可相互作用，共同加重再灌注損傷[13]。研究發現，腦缺血再灌注后可釋放大量炎癥介質和炎癥因子，調控炎癥相關因子iNOS、COX-2等蛋白表達，進而引起腦組織水腫、破壞血腦屏障等，加重腦組織的損傷[14]。本研究發現，模型組iNOS、COX-2蛋白表達均高于正常對照組，提示PC12細胞在缺血再灌注后出現了炎癥反應；辛芍組方各劑量組iNOS、COX-2蛋白表達均低于模型組，提示不同劑量的辛芍組方均對缺血再灌注損傷后細胞內的iNOS、COX-2蛋白表達有明顯的抑制作用，從而抑制缺血再灌注損傷后的炎癥反應。

NF-κB是一種常見的核轉錄因子，多以異源二聚體p50/p65形式存在于細胞中，正常條件下以靜息狀態被IκBα結合，形成NF-κB-IκBα復合物存在于細胞質內。當細胞受到某些細胞因子、氧化應激等刺激時，IκBα可發生磷酸化并與p50/p65解離，活化的NF-κB便從細胞質遷移至細胞核內，磷酸化的NF-κB p65參與調節細胞因子、炎癥反應、黏附分子表達、免疫反應等[15]。本研究發現，與正常對照組比較，模型組細胞質p-IκBα/IκBα值增加、細胞核內p65蛋白表達增加，提示缺血再灌注損傷后PC12細胞發生IκBα磷酸化及降解，IκBα與NF-κB解離，使NF-κB發生了核轉位，促進了NF-κB的表達；辛芍組方各劑量組p-IκBα、p65蛋白表達均低于模型組，提示辛芍組方各劑量組均可降低p-IκBα表達，抑制IκBα發生磷酸化，表明辛芍組方可能通過抑制IκBα的降解及細胞核p65的核轉運，從而抑制缺血再灌注損傷后PC12細胞NF-κB蛋白通路的活化，發揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用。

綜上所述，辛芍組方可通過減輕腦缺血再灌注損傷后的氧化應激及炎癥反應，從而發揮腦保護作用，其機制可能與其提高細胞的SOD活性、降低MDA水平，下調iNOS和COX-2蛋白表達，抑制NF-κB通路的激活有關。

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Effects of formula of Herba Erigerontis and Radix Paeoniae Rubra in OGD/R on oxidative stress and NF-κB signaling pathway of nerve cells after ischemia-reperfusion injury

DONGYongxi1,WANGXia,DONGLi,LIUZongyan,WANGAimin,LANYanyu

(1GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To observe the effect of the formula of Herba Erigerontis and Radix Paeoniae Rubra in oxygen-glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R) on oxidative stress and nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway of nerve cells (PC12 cells) after ischemia-reperfusion injury and to investigate its mechanism of protective effect. Methods The PC12 cells were cultured and divided into the control group, model group and low-dose, medium-dose and high-dose formula groups. The models of ischemia-reperfusion injury in the model group and formula groups were established by OGD/R. Then the rats in the low-dose, medium-dose and high-dose formula groups were treated with 0.31, 0.62, and 1.25 mg/L formula of Herba Erigerontis and Radix Paeoniae Rubra, and all were intervened for 4 h. The control and model groups were treated with DMEM only. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of malondialdehyde (MDA) in cell supernatant were detected by ELISA. The protein expression of NO synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) and the related proteins (IκBα, p-IκBα and p65) of NF-κB signaling pathway was examined by Western blotting.Results Compared with the control group, the level of SOD was decreased, the level of MDA was increased in the model group (allP<0.01). Compared with the model group, the level of SOD was increased in the medium-dose and high-dose formula groups (P<0.05 orP<0.01). The level of MDA was decreased in all formula groups (P<0.05 orP<0.01). Compared with the control group, the protein expression of iNOS and COX-2 was decreased in the model group (allP<0.01). Compared with the model group, the protein expression of iNOS and COX-2 was decreased in all formula groups (P<0.05 orP<0.01). Compared with the control group, the value of p-IκBα/IκBα in cytoplasm, and p65 in nucleus of the model group was increased (allP<0.01).Compared with the model group, the value of p-IκBα/IκBα in cytoplasm and p65 in nucleus of all formula groups (P<0.05 orP<0.01).Conclusions The formula has protective effect on PC12 cells after ischemia-reperfusion injury. The mechanism may be related to the reduction of intracellular oxidative stress response and inhibition of NF-κB pathway activation.

ischemia-reperfusion injury; neural cells; Herba Erigerontis and Radix Paeoniae Rubra; Chinese medicine; oxidative stress; nuclear factor-κB; inflammatory response; cerebral ischemia

國家自然科學基金資助項目(81260636，81060335)；貴州省優秀青年科技人才專項(黔科合人字2015-11)；貴州省高等學校創新能力提升計劃(黔教合協同創新字2013-04)；貴州省教育廳基金項目(黔科合KY字2013-122)。

董永喜(1983-)，男，碩士，講師，主要研究方向為心血管藥物設計與合成。E-mail: 108405755@qq.com

簡介：董莉(1985-)，女，碩士，副教授，主要研究方向為中藥藥效學、藥理學研究和安全性評價。E-mail: 108405755@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.002

R741.05

A

1002-266X(2016)42-0005-04

2016-05-23)