二甲雙胍對(duì)脂多糖激活小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響及機(jī)制探討

王海燕，張俊峰，郭勇，賈佩玉，王學(xué)敏

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海200233)

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·論著·

二甲雙胍對(duì)脂多糖激活小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響及機(jī)制探討

王海燕，張俊峰，郭勇，賈佩玉，王學(xué)敏

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海200233)

目的 觀察二甲雙胍對(duì)脂多糖(LPS)刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響，并探討其機(jī)制。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞，以臺(tái)盼藍(lán)拒染法觀察二甲雙胍是否具有細(xì)胞毒性作用。將BV2細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，LPS組予LPS 50 ng/mL刺激24 h；觀察組分別以0.02、2、8、16 mmol/L二甲雙胍預(yù)處理24 h，再以LPS 50 ng/mL 刺激24 h。采用ELISA法檢測(cè)兩組細(xì)胞上清液中的TNF-α水平，以細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算增殖細(xì)胞數(shù)，以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，以碘化丙啶染色+流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，以改良的碘化丙啶單染法+流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 不同濃度二甲雙胍處理的小膠質(zhì)細(xì)胞均臺(tái)盼藍(lán)拒染；與LPS組相比，觀察組隨著二甲雙胍濃度增加細(xì)胞上清液中TNF-α逐漸減少，增殖細(xì)胞數(shù)及增殖活性的吸光度值逐漸降低，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，2、8、16 mmol/L時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01、0.01)。觀察組隨著二甲雙胍濃度增加，G1期細(xì)胞比例逐漸增加，8、16 mmol/L時(shí)與LPS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01)。結(jié)論 二甲雙胍能減少LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放，其機(jī)制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

二甲雙胍；小膠質(zhì)細(xì)胞；脂多糖；腫瘤壞死因子；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞的主要免疫防護(hù)細(xì)胞，密切監(jiān)護(hù)中樞系統(tǒng)微環(huán)境的變化[1]。正常生理情況下小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，胞體較小，突起較少，具有一定的遷移能力，但缺乏吞噬功能，可分泌生長(zhǎng)因子維持神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化[2]。中樞系統(tǒng)的各種損傷都會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，形成阿米巴樣變。其激活是一個(gè)逐級(jí)進(jìn)展的過(guò)程，最初表現(xiàn)為神經(jīng)保護(hù)作用，但在長(zhǎng)期慢性炎癥刺激下，處于持續(xù)激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量促炎因子(如TNF-α)及超氧化合物；這些物質(zhì)具有神經(jīng)元毒性，不斷蓄積會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元退化、變形甚至死亡，是阿爾茨海默病、帕金森病和多發(fā)性硬化癥等許多神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制之一[3]。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，減少炎癥因子釋放，可能是治療神經(jīng)退行性疾病的有效措施之一。

二甲雙胍從上世紀(jì)50年代起便廣泛用于2型糖尿病的治療，其通過(guò)增加胰島素受體的敏感性來(lái)降低血糖[4]。近年來(lái)多項(xiàng)臨床及基礎(chǔ)研究均發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在外周與中樞神經(jīng)具有抗炎作用[5]。大部分研究認(rèn)為，其抗炎機(jī)制與激活A(yù)MPK、抑制NF-κB核轉(zhuǎn)移從而減少炎癥因子釋放有關(guān)[6，7]。而慢性炎癥反應(yīng)是神經(jīng)退行性疾病的重要致病原因，提示二甲雙胍對(duì)神經(jīng)退行性疾病可能有一定的治療作用。在一些腫瘤疾病中，二甲雙胍具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用[8]。迄今，未發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖作用的研究。2016年2～6月，我們觀察了二甲雙胍對(duì)脂多糖(LPS)過(guò)度激活小膠質(zhì)細(xì)胞的作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：BV2小膠質(zhì)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。試劑：二甲雙胍鹽酸鹽、LPS、碘化丙啶、RNA酶(Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基、PBS、不含DMSO的胰蛋白酶(Gibco 公司)，1%青鏈霉素混合液(Invitrogen公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，臺(tái)盼藍(lán)、MTT試劑盒(江蘇碧云天公司)，磷酸氫二鈉、枸櫞酸(浙江天杭生物科技有限公司)。儀器：超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher 公司)，倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)，多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，倒置相差顯微鏡(佳能公司)，酶標(biāo)分析儀(Bio-tek公司)，流式細(xì)胞儀(Becton-Dickiinson公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將BV-2細(xì)胞以DEME培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)于37 ℃以5%CO2、95%空氣恒溫箱培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液1次；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%左右時(shí)，以0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 二甲雙胍細(xì)胞毒性觀察 采用臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞膜完整性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2細(xì)胞，以1×105/孔接種6孔板；以0.02、2、8、16 mmol/L二甲雙胍預(yù)處理24 h后，1 000 r/min離心5 min；棄去上清液，加入PBS制成1×105/mL的單細(xì)胞懸液；取500 μL細(xì)胞懸液，加入 0.4%臺(tái)盼藍(lán)工作液500 μL，2 min內(nèi)倒置顯微鏡下觀察。死亡細(xì)胞因失去細(xì)胞膜完整性被染成藍(lán)色，活細(xì)胞拒染。

1.2.3 細(xì)胞分組與處理 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV-2細(xì)胞，以1×105/孔接種于6孔板，隨機(jī)分為L(zhǎng)PS組及觀察組；LPS組給予LPS 50 ng/mL刺激24 h；觀察組分別以0.02、2、8、16 mmol/L二甲雙胍預(yù)處理24 h，再以LPS 50 ng/mL 刺激24 h。

1.2.4 BV2細(xì)胞上清液TNF-α水平檢測(cè) 采用ELISA法。以5×104/孔接種于24孔板，分組與處理同1.2.3。收集細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照TNF-α試劑盒步驟操作；最后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度，以此表示TNF-α水平。

1.2.5 BV2細(xì)胞計(jì)數(shù) 收集1.2.3兩組細(xì)胞，加入等體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)，2 min內(nèi)于光學(xué)顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。增殖細(xì)胞數(shù)=處理后細(xì)胞數(shù)-種板時(shí)細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 BV2細(xì)胞活性測(cè)定 采用MTT法。收集1.2.3兩組細(xì)胞，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱孵育4 h；移液器移走細(xì)胞上清液后每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩器上避光震蕩至顆粒溶解。于自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm處，測(cè)定各孔吸光度表示細(xì)胞活性。

1.2.7 BV2細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用碘化丙啶染色+流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。收集1.2.3兩組細(xì)胞，PBS洗滌2次；500 μL DMEM 重懸細(xì)胞，加入-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇2 mL進(jìn)行固定；注意邊加乙醇邊輕柔震蕩，以防細(xì)胞粘連。-20 ℃過(guò)夜后， PBS洗滌2次；加1 mL DNA抽提掖(0.2 mol/L Na2HPO4192 mL 與 0.1 mol/L枸櫞酸8 mL混合，調(diào)整pH至7.8)，冰上靜置30 min；1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入400 μL PBS，加RNA酶(100 μg/mL)，37 ℃孵育30 min；然后加碘化丙啶(50 μg/mL)4 ℃避光孵育30 min。在流式細(xì)胞儀上測(cè)定細(xì)胞各期DNA含量，使用Modifit軟件進(jìn)行細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍細(xì)胞毒性觀察結(jié)果 臺(tái)盼藍(lán)染色后未見(jiàn)明顯細(xì)胞藍(lán)染，說(shuō)明二甲雙胍細(xì)胞毒性不明顯。

2.2 二甲雙胍對(duì)BV2細(xì)胞TNF-α 釋放的影響 LPS組BV2細(xì)胞上清液TNF-α水平為134.1±0.78；觀察組以0.02、2、8、16 mmol/L二甲雙胍處理24 h，BV2細(xì)胞上清液中TNF-α水平分別為134.60±0.34、125.40±0.48、110.70±0.55、92.69±0.94。與LPS組相比，觀察組隨著二甲雙胍濃度增加TNF-α的釋放逐漸減少，2、8、16 mmol/L時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01、0.01)。

2.3 二甲雙胍對(duì)BV2細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 觀察組以0.02、2、8、16 mmol/L二甲雙胍處理24 h，BV2增殖細(xì)胞數(shù)分別為(8 890±440)、(6 800±405)、(5 050±420)、(3 060±390)個(gè)，LPS組增殖細(xì)胞數(shù)為(9 000±340)個(gè)。觀察組2、8、16 mmol/L二甲雙胍處理后較LPS組增殖細(xì)胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01、0.01)。

2.4 二甲雙胍對(duì)BV2細(xì)胞增殖活性的影響 觀察組以0.02、2、8、16 mmol/L二甲雙胍處理24 h，BV2細(xì)胞增殖活性的吸光度值分別為1.577±0.281、1.210±0.237、1.018±0.186、0.734±0.143，對(duì)照組為1.539±0.274。觀察組2、8、16 mmol/L二甲雙胍處理后較LPS組增殖活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01、0.01)。

2.5 二甲雙胍對(duì)BV2細(xì)胞周期及凋亡的影響 觀察組隨著二甲雙胍濃度的增加，G1期細(xì)胞比例逐漸增加，8、16 mmol/L時(shí)同LPS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01)。觀察組隨著二甲雙胍濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加，2、8、16 mmol/L時(shí)與LPS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、0.01、0.01)。見(jiàn)表1。

表1 二甲雙胍對(duì)BV2細(xì)胞周期及凋亡的影響±s)

注：與LPS組比較，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥是神經(jīng)退行性疾病的病理特征之一，小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活釋放大量炎性因子，損傷神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展[9]。近期大量研究顯示二甲雙胍具有抗炎作用，且在證實(shí)二甲雙胍可以通過(guò)血腦屏障[10]后，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)二甲雙胍具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗炎作用[11]。與之前研究結(jié)果一致，本研究同樣觀察到二甲雙胍可減少內(nèi)毒素(如LPS)引起的TNF-α釋放。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著二甲雙胍濃度增加，其抗制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng)。結(jié)合其抗炎作用可推測(cè)，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡可能是二甲雙胍抑制中樞炎性作用的機(jī)制之一。

本研究為排除二甲雙胍自身毒性作用干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，首先進(jìn)行了臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度二甲雙胍均未引起細(xì)胞藍(lán)染，證實(shí)細(xì)胞膜并未受損，排除了二甲雙胍自身毒性作用導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然后我們發(fā)現(xiàn)，隨著二甲雙胍濃度增加，小膠質(zhì)細(xì)胞增殖細(xì)胞數(shù)及增殖細(xì)胞活降低。這些結(jié)果再次證實(shí)，二甲雙胍通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖發(fā)揮作用，而不是自身毒性作用所致。

細(xì)胞周期包括G1、S、G2、M期4個(gè)時(shí)期，其中G1期是惟一能接受外界信息刺激的時(shí)期，位于該期的限制點(diǎn)的轉(zhuǎn)換決定細(xì)胞是繼續(xù)增殖進(jìn)入S期，還是停滯進(jìn)入G0期，亦或者發(fā)生程序性死亡，即凋亡[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，中樞慢性炎癥反應(yīng)與小膠質(zhì)細(xì)胞周期蛋白過(guò)度表達(dá)有關(guān)，且抑制小膠質(zhì)細(xì)胞周期具有神經(jīng)保護(hù)作用[13,14]。Gusain等[15]研究發(fā)現(xiàn)，鞘髓磷脂酶抑制劑D609阻滯小膠質(zhì)細(xì)胞于G1期，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，在腦卒中起保護(hù)作用。Elsisi等[16]也發(fā)現(xiàn)，非甾體類抗炎藥布洛芬可以阻滯小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期，并促進(jìn)其凋亡。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍阻滯小膠質(zhì)細(xì)胞周期于G1期，抑制其增殖，并減弱了LPS導(dǎo)致的促炎因子釋放。我們進(jìn)一步檢測(cè)二甲雙胍是否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)采用改良的碘化丙啶單染法檢測(cè)。碘化丙啶染色法是流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法，RNA酶降解掉RNA后，碘化丙啶與細(xì)胞內(nèi)的DNA特異性結(jié)合，通過(guò)流式細(xì)胞儀反映出DNA的分布情況。細(xì)胞凋亡時(shí)，核內(nèi)DNA裂解成許多小片段，在乙醇固定的作用下脫出細(xì)胞，因此細(xì)胞內(nèi)的DNA含量減少，結(jié)合的碘化丙啶減少，從而形成一個(gè)DNA含量小于G1期的分布區(qū)，即凋亡峰。但是，這種方法中，較大的DNA片段可能無(wú)法脫出細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的DNA含量減少不明顯，不易觀察到凋亡峰。改良的碘化丙啶單染法增加了DNA抽提掖對(duì)固定細(xì)胞的處理，DNA抽提液增加細(xì)胞膜的通透性，提高裂解的DNA片段抽提能力，促使凋亡細(xì)胞內(nèi)斷裂的小DNA片段徹底脫出細(xì)胞，明顯提高識(shí)別凋亡細(xì)胞的敏感性[17]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組隨著二甲雙胍濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。

綜上所述，二甲雙胍能減少LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放，其機(jī)制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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Effect of metformin on release of inflammatory factor from LPS-stimulated microglia and its possible mechanism

WANGHaiyan,ZHANGJunfeng,GUOYong,JIAPeiyu,WANGXuemin

(ShanghaiSixthPeople'sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200233,China)

Objective To observe the effect of metformin on the release of inflammatory factor from lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia and to investigate the possible mechanism. Methods The cytotoxicity of metformin to BV2 cells in logarithmic growth phase was tested by Trypan blue exclusion. Then BV2 cells were randomly divided into LPS stimulation group (LPS group, cells were cultured with LPS in 50 ng/mL for 24 hours) and LPS plus Metformin group (observation group, cells were cultured with metformin in 0.02, 2, 8, and 16 mmol/L for 24 hours first, then cultured with LPS in 50 ng/mL for 24 hours). TNF-α was detected by ELISA. The proliferation was calculated by Cell counting. The cell viability was tested by MTT. The cell cycle was evaluated by propidium iodide staining + flow cytometry. The apoptotic rate was analyzed by improved propidium iodide staining + flow cytometry. Results The microglia treated with different concentrations of metformin refused staining of the trypan blue exclusion. Compared with LPS group, metformin decreased the level of TNF-α, inhibited the proliferation of microglia and increased the apoptotic rate in a dose-dependent manner (P<0.05, 0.01, 0.01 at 2, 8, and 16 mmol/L respectively). With the increased metformin concentration, the percentage of microglia in the G1phase was increased. Significant difference was found in the percentage of microglia in the G1phase between the LPS group and observation group with 8 and 16 mmol/L (P<0.05,P<0.01).Conclusion Metformin decreases the release of inflammatory factor from LPS-stimulated microglia, and the mechanism may be related to the inhibition of microglia proliferation and promotion of microglia apoptosis.

metformin; microglia; lipopolysaccharide; tumor necrosis factor; cell cycle; apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助面上項(xiàng)目(81571035)。

王海燕(1983-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要研究方向?yàn)檎J(rèn)知功能障礙。E-mail： 286679152@qq.com

簡(jiǎn)介：王學(xué)敏(1971-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)橹匕Y醫(yī)學(xué)。E-mail： iamgul@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.001

R363.2

A

1002-266X(2016)42-0001-04

2016-07-06)