凝血酶抑制劑nexin-1尾狀核注射對大鼠腦出血后腦水腫的治療作用

賈文志，趙金超，武海龍，李鵬，趙鳳鳴，姚志剛，孫曉立

(1石家莊市第三醫院，石家莊 050011；2石家莊市第五醫院)

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凝血酶抑制劑nexin-1尾狀核注射對大鼠腦出血后腦水腫的治療作用

賈文志1，趙金超2，武海龍1，李鵬1，趙鳳鳴1，姚志剛1，孫曉立1

(1石家莊市第三醫院，石家莊 050011；2石家莊市第五醫院)

目的 觀察凝血酶抑制劑nexin-1尾狀核注射對大鼠腦出血后腦水腫的治療作用。方法 將90只Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組和干預組各30只。模型組、干預組尾狀核注射自體動脈血制備腦出血大鼠模型，對照組注射等量生理鹽水；對照組、模型組術后于大腦尾狀核部位注射10 μL生理鹽水，干預組注射10 μL凝血酶抑制劑nexin-1。各組大鼠在給藥后12、24、36 h分別進行腦組織形態學觀察、腦組織凋亡神經細胞檢測、腦組織含水量檢查和腦組織血腦屏障通透性檢測。結果 干預組腦神經細胞排列有輕微紊亂，形態結構異常程度較輕，細胞核有胞核固縮和胞質凝集的現象，但程度較模型組輕。與對照組相比，模型組各時間點凋亡神經細胞數多、腦組織含水量高、血腦屏障通透性高(P均<0.05)。與模型組相比，干預組各時間點凋亡神經細胞數少、腦組織含水量低、血腦屏障通透性低(P均<0.05)。結論 凝血酶抑制劑nexin-1尾狀核注射對大鼠腦出血后腦水腫具有治療作用。

凝血酶抑制劑；腦出血；腦水腫

腦出血后易發生多種并發癥，其中腦水腫是腦出血最常見和最嚴重的并發癥[1,2]。凝血酶作為一種絲氨酸蛋白酶，在腦出血后的炎癥反應、腦細胞毒性損傷、腦水腫等并發癥的發生發展中起重要作用[3～6]。凝血酶抑制劑nexin-1是一種內生的絲氨酸蛋白水解酶，能迅速抑制凝血酶的表達及活性。本研究觀察了nexin-1尾狀核注射對大鼠腦出血后腦水腫的治療作用，為臨床上治療腦出血后腦水腫提供依據和方法。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級Wistar大鼠90只，雄性，體質量200～250 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(黑)：2013-002。

1.2 主要試劑及儀器 凝血酶抑制劑nexin-1(Gibco公司)，水合氯醛(山東齊魯制藥廠)，伊文思藍(Bioworlde公司)。立體定位儀(Amersham Biosciences公司)，分析天平(上海精密科學儀器有限公司)，分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)。

1.3 大鼠腦出血模型制備及nexin-1用法 將90只Wistar大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組和干預組各30只。模型組、干預組采用自體動脈血注射的方法制備腦出血大鼠模型：大鼠適應性喂養1周，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，后置于立體定位儀，在大鼠頭皮正中行切口，左側顱骨鉆孔(中線旁開3 mm，前囟前0.2 mm)，將動脈血(50 μL尾動脈自體血，不加抗凝劑)迅速注入顱骨下5.5 mm的左側尾狀核，然后換另一側，盡量減少反流，用骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮。對照組尾狀核部位注射等量生理鹽水，其余手術步驟與上述一致。對照組、模型組術后于大腦尾狀核部位注射10 μL生理鹽水，干預組注射10 μL凝血酶抑制劑nexin-1。

1.3 觀察方法

1.3.1 腦組織形態學觀察 將各組大鼠在給藥后12、24、36 h腹腔注射3.5%的水合氯醛，麻醉后迅速斷頭取出腦組織，以進針孔(尾狀核的所在位置)為界，冠狀切開腦組織，取其前半部腦出血周圍厚度為3 mm的腦組織標本，用10%甲醛固定、脫水、包埋，用石蠟切片機對包埋后的腦組織標本進行切片，切片厚度為5 μm，對切片進行脫蠟和HE染色，在光學顯微鏡下對各組大鼠的腦組織形態進行觀察。

1.3.2 大鼠腦組織凋亡神經細胞檢測 取各組大鼠腦組織石蠟切片，使用TUNEL染色法檢測大鼠腦組織中的凋亡神經細胞。用倒置顯微鏡觀察，在400倍鏡視野下隨機選取5個視野觀察并記錄陽性細胞數。以腦組織神經細胞質或細胞核中出現棕黃色顆粒作為腦組織神經細胞凋亡的陽性判斷標準。

1.3.3 大鼠腦組織含水量檢測 采用干濕重法對各組大鼠腦組織含水量進行檢測。各組大鼠在腹腔麻醉處死后迅速取出大腦，并快速稱取大腦濕重，然后將大腦放在95 ℃的烘箱中烘烤24 h，快速稱取大腦干重。大鼠腦組織含水量=(大腦濕重-大腦干重)/大腦濕重×100%。

1.3.4 大鼠血腦屏障通透性檢測 各組大鼠在各處理時間點處死前1 h尾靜脈注射2%伊文思藍(0.3 mL/100 g)，當大鼠的眼球結膜和四肢出現藍色時表明伊文思藍注射成功，停止注射。取大鼠大腦雙側的紋狀體和皮層(在取之前將大鼠左心室灌注生理鹽水，直至大鼠的右耳有清亮色的液體流出)，用分析天平進行精密稱重。將稱重后的紋狀體和皮層放在容量為5 mL的二甲基甲酰胺溶液試管中，37 ℃水浴48 h，3 000 r/min離心15 min，收集上清液。采用分光光度法檢測上清液中伊文思藍在632 nm波長處的最大吸光度，根據伊文思藍的標準曲線計算紋狀體、皮層中伊文思藍的含量。

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織病理形態 對照組大鼠大腦皮層中的腦組織結構正常，神經細胞形態正常并且排列順序整齊，腦皮層中的細胞著色均勻，細胞核為藍色，細胞質為淡紅色。模型組大鼠大腦皮層中的腦組織結構出現異常變化，神經細胞之間的間隙增大并且排列順序紊亂，神經細胞出現顯著性變異，有部分神經細胞出現凋亡現象(細胞核核質濃縮，并且細胞核固縮、溶解，細胞質凝集，細胞體積減小)，在12 h時最為嚴重，隨后異常程度減輕。干預組腦神經細胞排列輕微紊亂，形態結構異常程度較輕，細胞核仍然有胞核固縮和胞質凝集的現象，但程度較模型組輕；隨著干預時間的延長，腦組織病理異常恢復的程度逐漸增加。

2.2 各組大鼠腦組織凋亡神經細胞數比較 結果見表1。

表1 給藥后不同時間各組大鼠腦組織凋亡神經細胞數比較(個，±s)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織含水量比較 結果見表2。

表2 給藥后不同時間各組大鼠腦組織含水量比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.4 各組大鼠腦組織血腦屏障通透性比較 各組大鼠腦組織皮層、紋狀體伊文思藍含量比較見表3。

表3 給藥后不同時間各組大鼠腦組織皮層、紋狀體伊文思藍含量比較±s)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

3 討論

腦出血是臨床中的常見疾病，常采用甘露醇脫水治療[7]。腦出血在臨床中有較高的病死率和致殘率，在發病30 d內的病死率高達50%，未死亡的腦出血患者在6個月內僅有20%左右的患者能有功能意義上的恢復[8]。致使腦出血患者死亡和殘疾的主要危險因素是腦出血后早期對腦神經細胞的毒性以及晚期腦水腫，其中腦水腫是最重要的危險因素[9]。凝血酶在正常人大腦中的量極少，但腦出血后產生的血腫塊可以誘發產生大量的凝血酶[10]。少劑量的凝血酶在機體發生出血時有非常重要的保護作用[11,12]，可以保護腦神經細胞和腦星形細胞，避免其因為微環境的缺血、缺氧、低血糖而死亡；可以促進腦膠質細胞合成和分泌神經生長因子，進而促進腦神經細胞軸突生長；可以降低出血范圍的增加，減輕腦水腫。但同時還有研究發現，大劑量的凝血酶在腦出血后腦損傷中起著非常重要的作用，特別是與腦出血后腦水腫的發生關系密切。大劑量的凝血酶會促進腦出血后腦神經細胞損傷、腦血腫、炎癥、腦神經細胞凋亡等[13]。動物實驗[14]表明，腦出血后并發的腦水腫主要是由于大量的凝血酶產生的毒性作用所引起的。可見，凝血酶為腦出血后并發腦水腫的啟動點，通過調節腦出血后凝血酶的水平及活性成為治療腦出血的一個新方法。

凝血酶抑制劑nexin-1是一種內生的凝血酶抑制劑，是44 kD的絲氨酸蛋白水解酶，屬于連接蛋白家族和絲氨酸超家族[15]。nexin-1能迅速抑制凝血酶，通過絲氨酸蛋白酶催化劑與凝血酶形成穩定的SDS復合物[16]。nexin-1和凝血酶在神經系統創傷早期或損傷血腦屏障的其他情況下可以調節星型膠質細胞和神經細胞的生存能力。nexin-1主要分布在腦血管內和腦血管周圍，當腦內血腦屏障的通透性增加時，nexin-1可以對抗凝血原，降低凝血酶的活性，進而降低凝血酶對腦神經細胞的毒性及腦水腫[17,18]。本研究中腦出血大鼠相較于正常大鼠，腦神經細胞排列紊亂、間隙增加，并有部分腦神經細胞出現凋亡，而用nexin-1干預大鼠腦組織異常病理變化程度降低，且干預組腦組織凋亡神經細胞數較模型組少，可見nexin-1對腦出血后大鼠大腦組織具有保護作用。同時，nexin-1可以降低腦出血后腦組織的含水量和血腦屏障的通透性，說明nexin-1可以通過改善腦出血后血腦屏障損傷，降低血腦屏障的通透性，降低腦水腫，保護腦組織。

綜上可見，凝血酶抑制劑nexin-1尾狀核注射對大鼠腦出血后腦水腫具有治療作用。

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孫曉立(E-mail： 15030182566@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.015

R743.34

A

1002-266X(2016)35-0048-03

2015-09-25)