轉染ClC-3 siRNA的大鼠成骨細胞增殖、分化觀察

李琴，何伶俐，陳婷婷，龍密密，王誠

(六盤水市人民醫院，貴州六盤水 553001)

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轉染ClC-3 siRNA的大鼠成骨細胞增殖、分化觀察

李琴，何伶俐，陳婷婷，龍密密，王誠

(六盤水市人民醫院，貴州六盤水 553001)

目的 觀察轉染ClC-3 siRNA的大鼠成骨細胞增殖、分化情況。方法 原代提取成骨細胞，將細胞分為四組,Control組細胞不做任何處理，NC組細胞轉染無序siRNA，Lipo組細胞轉染LipofectamineTM2000轉染試劑，ClC-3 siRNA組細胞轉染ClC-3 siRNA,各組細胞加載流體剪切力行力學刺激。采用MMT法檢測各組細胞培養24、48、72 h時的光密度值；同時檢測各組細胞堿性磷酸酶水平及成骨細胞鈣化結節形成能力。結果 與Control組相比，ClC-3 siRNA組細胞各時點光密度值降低(P均<0.01)。ClC-3 siRNA組、Lipo組、NC組、Control組成骨細胞堿性磷酸酶水平分別為(32.434±2.130)、(46.199±1.900)、(47.347±2.500)、(49.540±1.550)U/mL，鈣化結節形成能力分別為25.02%±3.46%、36.83%±4.54%、38.45%±4.84%、40.57%±2.22%，ClC-3 siRNA組與Control組相比，P均<0.01。結論 轉染ClC-3 siRNA可抑制大鼠成骨細胞的增殖、分化。

基因轉染；ClC-3蛋白；成骨細胞；氯通道；流體剪切力；細胞增殖；細胞分化；堿性磷酸酶

離子通道如鈣離子通道[1]、鉀離子通道[2]等與成骨分化及其相關功能有關，但氯離子通道與成骨的相關作用仍不甚了解。ClC家族屬于電壓門控類的離子通道，其家族成員ClC-3不僅在細胞容積調控中起重要作用，還與細胞增殖[3]、凋亡[4]、遷移[5]、破骨細胞的細胞內酸化調節[6]等相關。研究[7]報道，氯通道參與成骨細胞的代謝活動。流體剪切力(FSS)是研究骨細胞對力學刺激反應的方法。本研究用ClC-3 siRNA下調ClC-3氯通道蛋白表達，觀察轉染ClC-3 siRNA的大鼠成骨細胞增殖、分化情況。

1 材料與方法

1.1 試劑 胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素(Hyclone，美國)；ClC-3一抗是兔源的多克隆抗體(Abcam，美國)；β-actin一抗購自博士德生物科技有限公司；二抗山羊抗兔IgG(H+L)購自碧云天公司(上海，中國)；堿性磷酸酶(ALP)染液D001-1購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞培養、鑒定 取4只36 h內出生的SD大鼠，拉頸處死，置75%乙醇浸泡20 min。取頭蓋骨置于無菌PBS液中，仔細刮除表面骨膜、血管等結締組織，將頭蓋骨剪碎至1 mm3大小，轉移至15 mL離心管，1 000 r/min離心，去上清。加入0.25%胰酶溶液，37 ℃消化15 min。加入200 U/mL膠原酶Ⅰ消化液，37 ℃震蕩60 min。加入含10%胎牛血清(Gibco，美國)的DMEM(Gibco，美國)完全培養基終止消化，1 000 r/min離心5 min，去上清。加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，轉移至培養瓶，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養，待細胞長到占培養皿的80%左右時進行細胞傳代，每隔2～3 d傳代1次。取第3代的細胞，進行鑒定。將細胞接種在12孔板，48 h后按照ALP染液操作說明書進行鑒定。倒置相差顯微鏡(Olympus CKX41，日本)觀察，拍照，非貼壁的成骨細胞呈球形，懸浮于培養液中并逐漸沉降貼壁，剛貼壁的活細胞形態呈不規則多角形，細胞核單核呈卵圓形，慢慢長匯合時細胞呈鋪路石狀，并可重疊生長，細胞核呈淡綠色，胞質呈現紅色至紅棕色，提示成功提取成骨細胞。

1.2.2 細胞分組及ClC-3 siRNA轉染 轉染前1 d將對數生長期的細胞用不含抗生素的培養液制成細胞懸液，接種于6孔板中，過夜。將細胞分為四組，Control組細胞不做任何處理，NC組細胞轉染無序siRNA，Lipo組細胞轉染LipofectamineTM2000轉染試劑，ClC-3 siRNA組細胞轉染ClC-3 siRNA。本研究中的ClC-3 siRNA為對應于鼠源的ClC-3氯離子通道基因的siRNA雙鏈，由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成，正義鏈序列：5′-CGAGAGAAGUGUAAGGACATT-3′，反義鏈序列：5′-UGUCCUUACACUUCUCUCGTT-3′。NC組正義鏈序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。用不含血清和抗生素的DMEM培養液稀釋LipofectamineTM2000和20 μmol/L siRNA，每孔用量分別為5、10 μL，室溫孵育5 min；將siRNA懸液和LipofectamineTM2000懸液混合，再孵育20 min；用不含血清和抗生素的DMEM培養液洗滌細胞3次，6孔細胞培養板每孔加入1 600 μL無血清和抗生素的DMEM培養液，將LipofectamineTM2000和siRNA混合液緩慢滴加到各孔內，使終濃度為100 nmol/L，細胞繼續培養6 h后換正常培養液，共培養48 h。大鼠成骨細胞ClC-3蛋白檢測采用Western blotting法。常規方法提取上述四組細胞總蛋白。將得到的蛋白進行BCA蛋白定量及變性，每孔加樣20 μL(約含40 μg總蛋白)，用10%的SDS-PAGE進行電泳和半干轉膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，ClC-3兔多克隆抗體和β-actin 4 ℃孵育過夜；TBST漂洗3次，每次10 min；然后與山羊抗兔IgG(H+L)二抗室溫孵育1 h，用TBST進行3次漂洗，每次10 min。采用ECL化學發光法進行顯影。Image J 軟件進行圖像分析，測定灰度值，以β-actin為內參，計算相對比值。發現ClC-3 siRNA組較Control組的ClC-3蛋白表達下降(P<0.01)，NC組、Lipo組與Control組ClC-3蛋白表達差異無統計學意義。

1.2.3 大鼠成骨細胞FSS加載方法 用細胞拉應力、壓應力、流體切應力加載分析系統(FX-5000，Flexcell，美國)加載FSS。系統以流室系統和灌流系統的其他部分組成完整的閉合環路，蠕動泵提供負壓動力，推動灌流液循環。以2×104/cm2的密度將轉染中的上述四組細胞接種在預置于培養皿中的長方形(50 mm×20 mm×0.20 mm)蓋玻片上，加入完全培養液，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養過夜，使細胞貼壁融合生長。將蓋玻片放入流室系統(預先紫外線照射1 h)的方形槽中，流經成骨細胞的切應力、流量以及流室之間的關系公式為τ=6Qμ/bh2。其中τ為腔底切應力(細胞所受的力，dyne/cm2)，Q為循環液流量(cm3/s)，μ為循環液黏度(0.01 dynes/cm2)，b為流室寬度(約為2 cm)，h為流室高度(約為0.025 cm)。調整蠕動泵轉速為28 r/min，通過流動腔流量Q為49.7 mL/min(0.833 cm3/s)，根據上述公式得出τ約為1.2 Pa(1.2 Pa=12 dyne/cm2)。加載時間為30 min/次，每隔24 h一次，持續72 h，相當于人每天運動30 min，模仿替代骨骼所受的生理刺激。

1.2.4 成骨細胞增殖能力觀察 MTT法檢測細胞增殖能力。按每孔100 μL、細胞懸液濃度為2.5×107cells/L處理后的細胞加入96孔培養板。分別觀察培養24、48、72 h后的OD值。在檢測OD值前加入MTT液10 μL/孔(5 g/L)，37 ℃孵育4 h，棄去液體，每孔加入100 μL鹽酸異丙醇溶解15～30 min，全自動酶標儀測定570 nm波長的OD值。OD值代表細胞增殖能力。

1.2.5 成骨細胞ALP測定 取上述處理后的四組細胞，消化，制成3×104～5×104/mL濃度的細胞懸液，按每孔100 μL加到96孔培養板中培養過夜。待細胞貼壁后，吸出96孔培養板的舊培養基，PBS洗2～3遍，按分組更換成已配置好的轉染培養基，每組設復孔5個，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中培養72 h。根據南京建成公司生產的ALP測定試劑盒稍作改良進行檢測，并計算ALP濃度。

1.2.6 成骨細胞鈣化功能觀察 取上述處理后的四組細胞，消化，同樣制成3×104～5×104/mL濃度的細胞懸液，按每孔500 μL接種于24孔培養板中培養過夜。待細胞貼壁后，倒棄培養基，PBS洗2～3遍，按實驗分組更換成已經配置好的轉染培養液，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中培養21 d，每2～3 d更換1次轉染培養液。培養至第21天時，倒棄培養基，PBS小心洗3次，加95%乙醇固定10 min。PBS輕輕反復洗滌5次，每次5 min。每孔加入0.1%茜素紅S(溶解于pH 8.3的Tris鹽酸)進行染色，置37 ℃培養箱孵育30 min。單蒸水洗3次，晾干。倒置顯微鏡下觀察，拍照,計算染色面積。

2 結果

2.1 各組成骨細胞OD值比較 結果見表1。

表1 不同培養時間各組成骨細胞OD值比較±s)

注：與Control組相比，*P<0.01。

2.2 各組成骨細胞ALP水平比較 ClC-3 siRNA組、Lipo組、NC組、Control組成骨細胞ALP濃度分別為(32.434±2.130)、(46.199±1.900)、(47.347±2.500)、(49.540±1.550)U/mL，ClC-3 siRNA組與Control組相比，P<0.01。

2.3 各組成骨細胞鈣化功能比較 ClC-3 siRNA組、Lipo組、NC組、Control組鈣化結節形成能力分別為25.02%±3.46%、36.83%±4.54%、38.45%±4.84%、40.57%±2.22%，ClC-3 siRNA組與Control組相比，P<0.01。

3 討論

人體的骨骼是一個具有很強調節能力的力學穩態調控系統[8]，能隨著日常生活中環境的變化而不斷地自我調整，以適應不斷變化的生物力學需求。骨組織對力學刺激敏感，能夠感受到各種力學信號的傳導，而且成骨細胞的細胞形態、分化和增殖也均與力學刺激相關[9]。FSS能促進成骨細胞增殖，并明顯促進細胞分化[10]。Pavalko等[11]認為骨細胞的陷窩-小管結構可以感受機械負荷引起的小管內FSS，改變細胞膜的現狀。目前認為骨細胞感受應力的主要方式是FSS使細胞發生形變，引發局部的電位改變，形成力學和電化學耦聯，介導力學信號在細胞內的傳導。骨組織中，能夠將機械刺激信號轉變為生化信號的傳感器可能是成骨細胞、骨細胞和骨襯里細胞。張力對骨組織的作用受到很多因素的影響，如力的大小、作用時間和速率等。一般加載的力小但時間長與較大而作用時間短的應力產生的蛋白合成效應結果相似[12]。氯通道參與成骨細胞的分化調節過程，小鼠成骨細胞MC3T3-E1在骨誘導分化過程中，高表達ClC-3氯通道蛋白，促進成骨分化[7]。另有文獻[13]報道，骨硬化病是由于缺乏氯通道家族亞型中的ClC-7所導致。

骨骼細胞力學傳導的重要組成成分包括調節一氧化氮和前列腺素E2的多囊腎蛋白2[14]、嘌呤信號途徑[1]、β-catenin在胞質內積聚[15]等，進而啟動核轉錄因子，發揮調控作用。本研究中的大鼠成骨細胞通過力學裝置加載FSS,模仿人體骨骼正常每天運動時所受的生理刺激。ClC-3氯通道是容積敏感性氯通道，與細胞容積調節、增殖、凋亡、周期、遷移或骨細胞內酸化調節密切相關。本研究主要探討ClC-3氯通道參與成骨細胞力學信號傳導可能機制，闡明ClC-3氯通道是否介導了FSS促進成骨細胞的增殖和分化。

本研究通過原代提取小鼠頭蓋骨成骨細胞，用ClC-3 siRNA下調ClC-3氯通道蛋白表達，觀察下調ClC-3氯通道對FSS刺激成骨細胞增殖和分化的影響，探討ClC-3作為FSS促進成骨細胞增殖和分化可能的潛在靶點。結果顯示，倒置顯微鏡下，成骨細胞呈不規則多角形，細胞核單核呈卵圓形，可重疊生長；ALP鑒定成骨細胞陽性反應為胞質中呈現紅色至紅棕色，提示成功提取成骨細胞。ClC-3 siRNA組的ClC-3蛋白的表達明顯下降。在確認ClC-3氯通道成功下調后，觀察下調ClC-3氯通道對FSS刺激成骨細胞增殖和分化的影響。FSS能促進成骨細胞的增殖，伴隨明顯的促進細胞分化[10]。那么氯通道是否參與了FSS促進成骨細胞的增殖？本研究結果顯示，下調ClC-3氯通道蛋白表達后成骨細胞增殖明顯被抑制，提示ClC-3可能介導了FSS促進成骨細胞的增殖。骨型ALP是成骨細胞分化和功能的標志物。鈣化結節形成能力是反映成骨細胞分化成熟功能的關鍵指標，通過茜紅素S染色，顯示鈣化結節。茜紅素S能與鈣化結節中的鈣離子螯合，產生桔紅色沉積，桔紅色沉積即是鈣化結節。骨型ALP和鈣化結節均是成骨細胞分化形成成熟骨細胞能力的關鍵指標。實驗結果顯示，ClC-3 siRNA組能明顯阻抑ALP的分泌并阻抑鈣化結節形成，推測ClC-3可能介導了FSS促進成骨細胞的分化。

哺乳動物對外界的環境極為敏感，能感受并傳導化學或力學信號。其中骨細胞對力學刺激尤為敏感，成骨細胞力學信號傳導的機制一直被研究，離子通道是學者們關注的焦點。離子通道的開放和關閉與力學刺激有關。FSS誘導的ATP釋放依賴于L型電壓敏感性鈣通道的開放使得鈣離子的進入細胞[1]。細胞與細胞之間的信號轉導，如嘌呤信號途徑[1]、β連環素在胞質內大量積聚[15]，增強縫隙連接和細胞內鈣釋放等，都是成骨細胞感受機械刺激并作出力學傳導的早期事件[16]。另外，機械刺激能產生一氧化氮，而一氧化氮的產生能增強骨骼強度和斷裂阻力，使得骨量和骨結構做出相應變化，以適應機械的刺激[17]。

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Observation of cell proliferation and differentiation in rat osteoblasts tranfected by ClC-3 siRNA

LIQin,HELingli,CHENTingting,LONGMimi,WANGCheng

(ThePeople'sMunicipalHospitalofLiupanshui,Liupanshui553001,China)

Objective To observe the cell proliferation and differentiation in rat osteoblasts which were transfected by ClC-3 siRNA.Methods The primary osteoblasts were extracted and divided into 4 groups: the control group which was not treated, negative control (NC) group which was transfected by unordered siRNA, Lipo group which was transfected by lipofectamineTM2000 transfection reagents only and the ClC-3 siRNA group which was transfected by ClC-3 siRNA. All cells were cultured in the flow shear stress installation. The optical density (OD) values at 24, 48 and 72 h after culture in each group were detected by MTT. The alkaline phosphatase level and calcified nodule was also detected. Results Compared with the control group, the OD value of the ClC-3 siRNA group was decreased at each time points (allP<0.05). The alkaline phosphatase levels and calcified nodule forming abilities in the ClC-3 siRNA, Lipo, NC and control groups were (32.434±2.130), (46.199±1.900), (47.347±2.500) and (49.540±1.550) U/mL, and 25.02%±3.46%, 36.83%±4.54%, 38.45%±4.84% and 40.57%±2.22%, respectively. Significant difference was found between the ClC-3 siRNA group and the control group (allP<0.01).Conclusion After transfection of ClC-3 siRNA, the cell proliferation and differentiation of rat osteoblasts is inhibited.

gene transfection; ClC-3 protein; osteoblasts; chloride channel; flow shear stress; cell proliferation; cell differentiation; alkaline phosphatase

李琴(1987-)，女，碩士，初級技師，主要從事免疫及分子生物學研究。E-mail: pan417076448@qq.com

簡介：王誠(1967-)，男，主任技師，主要從事免疫及分子生物學研究。E-mail: jywangcheng@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.007

R331

A

1002-266X(2016)35-0024-04

2015-08-23)