用自然周期方案、激素替代周期方案準備內膜的助孕治療者短時和過夜培養凍胚的移植結局觀察

范曉玲,王蕾,張亞鳳，胡蓉

(1彩虹醫院，陜西咸陽 712000;2咸陽市第一人民醫院；3寧夏醫科大學總醫院生殖醫學中心;4省部共建教育部生育力保持重點實驗室)

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用自然周期方案、激素替代周期方案準備內膜的助孕治療者短時和過夜培養凍胚的移植結局觀察

范曉玲1,王蕾2,張亞鳳1，胡蓉3,4

(1彩虹醫院，陜西咸陽 712000;2咸陽市第一人民醫院；3寧夏醫科大學總醫院生殖醫學中心;4省部共建教育部生育力保持重點實驗室)

目的 觀察用自然周期方案、激素替代周期方案準備內膜的助孕治療者短時和過夜培養凍融胚胎的移植結局。方法 293對夫婦采用冷凍-復蘇胚胎移植(FET)助孕治療，共337個移植周期，根據移植前內膜準備方法分為自然周期組(NC組，采用自然周期準備方案)和激素替代周期組(HRT組，采用激素替代周期準備方案)，每組再根據胚胎解凍后體外培養時間(短時培養和過夜培養)分層，觀察FET結局(種植率、臨床妊娠率、流產率、多胎率)。結果 NC組、HRT組種植率分別為32.69%、21.83%，臨床妊娠率分別為59.15%、41.73%，流產率分別為7.14%、16.22%，多胎率分別為21.43%、13.51%，NC組種植率和臨床妊娠率高于HRT組(P均<0.05)。NC組短時培養、過夜培養種植率分別為28.13%、35.87%，臨床妊娠率分別為53.57%、62.79%，流產率分別為6.67%、7.41%，多胎率分別為20.00%、22.22%，兩者比較差異均無統計學意義。HRT組短時培養、過夜培養種植率分別為21.92%、21.74%，臨床妊娠率分別為44.19%、39.42%，流產率分別為21.05%、11.11%，多胎率分別為12.28%、14.81%，兩者比較差異均無統計學意義。NC組、HRT組短時培養FET結局比較差異無統計學意義。與HRT組過夜培養者相比，NC組過夜培養者種植率和臨床妊娠率高(P均<0.05)。結論 自然周期較激素替代周期內膜準備方法可獲較好FET結局,主要體現在胚胎解凍后體外培養時間選擇為過夜培養時。

胚胎移植；內膜準備方法；自然周期；激素替代周期

冷凍-復蘇胚胎移植(FET)作為輔助生育技術(ART)的重要組成部分，可以有效預防卵巢過度刺激綜合征、多胎妊娠等體外受精-胚胎移植技術(IVF-ET)相關的并發癥，增加單次促排卵的累積妊娠率及胚胎的利用率[1]。然而，與新鮮胚胎移植周期相比結局仍不理想[2]。影響凍融胚胎移植結局的因素很多，人為可控的因素主要為內膜準備方法和解凍后移植時機。本研究觀察了用自然周期方案和激素替代周期方案準備內膜的助孕治療者短時和過夜培養凍胚的移植結局，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月～2011年12月在寧夏醫科大學總醫院生殖醫學中心行FET助孕治療的293對夫婦、337個移植周期資料。其中女方年齡19～35歲，不孕年限1～19年，BMI 18～25 kg/m2，子宮內膜厚度7～15 mm，每周期移植胚胎數1～3枚，原發不孕213周期，體外受精(IVF)方式受精183周期，自然周期內膜準備方案71周期。納入標準：女方年齡≤35歲、18 kg/m2≤BMI≤25 kg/m2、采用長方案促排卵、IVF/卵胞質內單精子顯微注射術(ICSI)周期數≤2、程序化慢速冷凍方法、胚胎均為受精后第3天冷凍、內膜準備方案為自然周期或激素替代。排除標準：女方年齡>35歲、BMI≥25 kg/m2或≤18 kg/m2、短方案或其他方式促排卵、IVF/ICSI周期數≥3、子宮內膜異位癥或子宮畸形、促排卵方式準備內膜。將337個周期按移植前內膜準備方法的不同分為自然周期組(NC組)和激素替代周期組(HRT組)；再根據胚胎解凍后體外培養時間的不同分層(短時培養和過夜培養，短時培養指解凍后培養1～5 h移植;過夜培養指移植前1 d解凍后過夜培養，一般解凍距移植時間16～20 h)。本研究所用胚胎均為優質可移植胚胎。NC組、HRT組女方年齡分別為(29.4±3.3)、(29.2±3.7)歲，不孕年限分別為(4.24±3.01)、(4.38±3.13)年，內膜厚度分別為(10.28±1.20)、(10.05±1.44)mm，BMI分別為(21.18±2.00)、(21.65±2.16)kg/m2，IVF方式受精分別占49.30%、55.64%，原發不孕分別占61.97%、63.54%，輸卵管因素導致不孕分別占77.46%、62.30%，男方因素導致不孕分別占18.31%、24.06%，排卵障礙導致不孕分別占4.23%、13.91%，內膜形態A型分別占2.82%、2.26%，內膜形態B型分別占76.06%、82.71%，內膜形態C型分別占21.13%、15.04%，兩組輸卵管因素導致不孕所占比例、排卵障礙導致不孕所占比例比較，P<0.05。

1.2 內膜準備及凍胚解凍、培養、移植方法 NC組采用自然周期準備方案。對月經規律、有排卵的患者，從月經周期第2、3天開始采用經引道B超監測卵泡，同時采集清晨空腹肘靜脈血，監測血清基礎促黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)及雌二醇(E2)水平；1周后監測優勢卵泡及血清LH、FSH和E2值，其后每日監測B超，待優勢卵泡發育至16 mm時檢測血LH、E2，排卵后3 d或LH峰后4 d且內膜≥8 mm時開始肌注黃體酮60～80 mg行黃體支持。3 d后解凍胚胎，短時培養或過夜培養后移植。

HRT組采用激素替代周期準備方案。對排卵障礙或周期不規律及既往自然周期內膜<7 mm的患者，于月經周期或撤退性出血的第2、3天起開始口服戊酸雌二醇，采用遞增方案，劑量在月經第2～5天為4 mg/d,第6～9天為6 mg/d。B超監測子宮內膜厚度，<8 mm時戊酸雌二醇加至8 mg/d口服維持，≥8 mm、E2>200 pg/mL時，開始肌注黃體酮60～80 mg/d行黃體支持。4 d后解凍胚胎，短時培養或過夜培養后移植，移植日開始肌注黃體酮60～80 mg/d支持。

1.3 FET結局觀察方法 妊娠判斷：胚胎移植后14 d測晨尿HCG陽性，血HCG>25 mIU/mL為生化妊娠，繼續行黃體支持；移植后4周行B超檢查，有孕囊及原始心管搏動為臨床妊娠，繼續黃體支持至孕12周。種植率(著床率)=孕囊數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；多胎率=多胎妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%。

2 結果

2.1 NC組、HRT組FET結局比較 NC組、HRT組移植周期數分別為71、266，移植胚胎數分別為156、591，種植率分別為32.69%(51/156)、21.83%(129/591)，臨床妊娠率分別為59.15%(42/71)、41.73%(111/266)，流產率分別為7.14%(3/42)、16.22%(18/111)，多胎率分別為21.43%(9/42)、13.51%(15/111)，NC組種植率和臨床妊娠率高于HRT組(P均<0.05)。

2.2 NC組短時培養、過夜培養者FET結局比較 NC組短時培養、過夜培養女方年齡分別為(29.3±3.6)、(29.5±3.1)歲，不孕年限分別為(3.11±2.94)、(4.30±2.38)年，內膜厚度分別為(10.36±1.83)、(10.95±1.83)mm，BMI分別為(20.98±2.11)、(21.31±1.95)kg/m2，IVF方式受精分別占50.00%、47.73%，原發不孕分別占67.86%、58.14%，輸卵管因素導致不孕分別占75.00%、79.07%，男方因素導致不孕分別占21.43%、16.28%，排卵障礙導致不孕分別占3.57%、4.65%，內膜形態A型分別占3.57%、6.98%，內膜形態B型分別占71.43%、74.42%，內膜形態C型分別占25.00%、18.60%，兩者比較差異均無統計學意義。NC組短時培養、過夜培養者移植周期數分別為28、43，移植胚胎數分別為64、92，種植率分別為28.13%(18/64)、35.87%(33/92)，臨床妊娠率分別為53.57%(15/28)、62.79%(27/43)，流產率分別為6.67%(1/15)、7.41%(2/27)，多胎率分別為20.00%(3/15)、22.22%(6/27)，上述指標兩者比較差異均無統計學意義。

2.3 HRT組短時培養、過夜培養者FET結局比較 HRT組短時培養、過夜培養女方年齡分別為(29.5±3.6)、(28.9±3.7)歲，不孕年限分別為(4.62±3.32)、(4.15±2.94)年，內膜厚度分別為(10.11±1.01)、(10.10±1.21)mm，BMI分別為(21.11±1.55)、(21.02±1.75)kg/m2，IVF方式受精分別占58.14%、53.28%，原發不孕分別占65.89%、61.31%，輸卵管因素導致不孕分別占61.24%、62.77%，男方因素導致不孕分別占24.81%、23.36%，排卵障礙導致不孕分別占13.95%、13.87%，內膜形態A型分別占1.56%、1.46%，內膜形態B型分別占83.72%、83.21%，內膜形態C型分別占14.73%、15.33%，兩者比較差異均無統計學意義。HRT組短時培養、過夜培養者移植周期數分別為129、137，移植胚胎數分別為292、299，種植率分別為21.92%(64/292)、21.74%(65/299)，臨床妊娠率分別為44.19%(57/129)、39.42%(54/137)，流產率分別為21.05%(12/57)、11.11%(6/54)，多胎率分別為12.28%(7/57)、14.81%(8/54)，上述指標兩者比較差異均無統計學意義。

2.4 NC組、HRT組短時培養者FET結局比較 NC組、HRT組短時培養者一般情況、FET結局比較差異均無統計學意義。

2.5 NC組、HRT組過夜培養者FET結局比較 NC組過夜培養者子宮內膜厚度大于HRT組(P=0.001)。NC組過夜培養者種植率和臨床妊娠率高于HRT組(P均<0.05)。其余指標NC組、HRT組過夜培養者相比差異均無統計學意義。

3 討論

胚胎著床是人類生殖的關鍵步驟，良好的子宮內膜容受性是FET能否成功的關鍵因素[3]。多年來，為了提高FET成功率，臨床醫生摸索出了多種內膜準備方案，其中，自然周期和激素替代周期是最常用的兩種方法。自然周期適用于平素月經規律、有自然排卵的患者，胚胎移植時機取決于監測到的LH峰(自發或HCG誘發)。激素替代周期用于既往月經不規律、無排卵且對促排卵無反應者，在該方案中，給患者應用外源性雌激素以模擬內源性雌激素促進子宮內膜增生的作用，抑制優勢卵泡的發育，適時添加孕激素實現子宮內膜向分泌期的轉化，綜合判斷移植時機。本研究結果顯示：NC組輸卵管因素導致不孕所占比例高于HRT組，而排卵障礙導致不孕所占比例低于HRT組，這符合兩種內膜準備方法的適應證。目前，究竟哪種內膜準備方法能獲得更好FET結局，仍存爭議。

我們的研究發現自然周期方案的著床率及臨床妊娠率均高于激素替代周期方案，這與Xiao等[4]、Levron等[5]的大樣本回顧性臨床研究結果相同。然而，Zheng等[6]則發現，相對于自然周期及半激素替代周期，激素替代方案可顯著提高著床率及臨床妊娠率，即使對于內膜≤8 mm者，激素替代周期仍能獲得較好FET結局。魏思達等[7]也認為激素替代周期能獲得滿意種植率，影響FET臨床妊娠率的因素包括女方年齡、FET日E2水平、移植胚胎的質量、移植胚胎的數目、移植胚胎的發育階段(細胞期或囊胚期)。另有學者認為各種內膜準備方法對FET結局的影響無差異：Groenewoud等[8]的一項Meta分析指出，在凍融胚胎移植中，各種內膜準備方案對于臨床妊娠率、繼續妊娠率及活產率沒有影響，對周期取消率的影響尚無定論。田莉等[9]也認為年齡是影響FET結局的關鍵因素，她們的研究結果顯示：對于年齡≤35歲者可根據是否有排卵而采用自然周期或激素替代周期，對移植及妊娠結局均無影響；而對于年齡>35歲者，建議采用激素替代周期方案準備內膜，這可能會提高FET臨床妊娠率。

解凍后移植時機是影響FET結局的另一可控因素。目前，FET選擇胚胎的依據主要為兩種形態學觀察結果，一種是觀察到解凍后胚胎卵裂球是否存活，這個過程只需短時培養(1～3 h)即可；另一種方法是胚胎解凍后經過夜培養，觀察細胞期胚胎卵裂球是否分裂、囊胚是否擴張等，即胚胎是否復蘇。目前，關于胚胎解凍后體外培養時間亦尚存爭議。Rato等[10]認為與過夜培養相比，短時培養與高臨床妊娠率和種植率相關；龔紹瓊[11]的研究結果與之相似，而后者還認為流產率的增加與延長體外培養時間有關。本研究共收集過夜培養180周期，短時培養157周期，在相同的內膜準備方法內，體外培養時間對FET結局影響無差別，這與Guo等[12]的研究結果相似；乜照燕等[13]認為對于優質胚胎，體外培養時間不影響FET結局；秦祖興等[14]研究結果顯示，延長體外培養時間不能改善胚胎質量，但是可以合理安排次日實驗室工作。本研究還發現，在相同培養時間內，兩種內膜準備方法短時培養FET結局無差異，而過夜培養時，自然周期方案內膜厚度大于激素替代周期方案，著床率及臨床妊娠率亦均高于后者。我國學者吳黎等[15]通過分析同濟醫院498個FET周期發現，延長凍融胚胎體外培養時間可以更好地根據胚胎發育潛能挑選優質胚胎移植,提高妊娠率,改善妊娠結局。柴三明等[16]也認為延長體外培養時間可以使胚胎與子宮內膜發育同步，還可使冷凍保護劑充分代謝，減少其對胚胎后續發育的影響，顯著提高胚胎發育潛能及臨床妊娠率。然而，上述所有研究均未涉及FET前子宮內膜準備方案，所以，相對而言，我們的研究結果更可信，更具臨床實用價值。

本研究的不足之處在于為回顧性研究，研究對象不能進行隨機分組，另外樣本量較小，但為了減少偏倚，本研究設有嚴格納入標準，使兩組對象具有可比性，確保結果的可靠性。

總之，自然周期方法準備內膜可獲得較好的FET結局，其子宮內膜增生及轉化所需的激素來源是卵泡發育產生的內源性性激素，符合生理要求，對內膜微環境的干擾小；而激素替代周期中子宮內膜生長及轉化完全依賴于外源性激素，其微觀環境受到一定程度損壞，影響了子宮內膜容受性。在臨床實際工作中，應綜合評估患者各方面情況，遵循個體化原則，對于有條件的患者，建議其首先考慮自然周期方法準備內膜。

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Observation on outcome of frozen-thawed embryo transfer between short-time and long-time culture to infertile patients whose endometria were prepared with natural or hormone replacement cycle protocol

FANXiaoling1,WANGLei,ZHANGYafeng,HURong

(1CaihongHospital,Xianyang712000,China)

Objective To observe the outcome of frozen-thawed embryo transfer (FET) between the short-time and long-time culture embryos of the infertile patients whose endometria were prepared with natural or hormone replacement cycle protocol.Methods A total of 293 patients and 337 FET cycles were enrolled, and all cycles were divided into two groups depending on their means of preparing the endometria: natural cycle (NC) protocol (NC group) and hormone replacement cycle (HRT) protocol (HRT group), each group was divided into two layers according to the culture time of thawed embryos in vitro: short-term and overnight layers. The outcomes of clinical pregnancy rate (CPR), implantation rate (IR), spontaneous abortion rate (SAR) and multiple pregnancy rate (MPR) per cycle were compared.Results In the NC and HRT groups, the IR was respectively 32.69% and 21.83%, the CPR was 59.15% and 41.73% , the SAR was 7.14% and 16.22%, the MPR was 21.43% and 13.51%, respectively, and the IR and CPR were all higher in the NC group than those of the HRT group (allP<0.05). In the short-term and overnight layers of the NC group, the IR was 28.13% and 35.87%, the CRP was 53.57% and 62.79%, the SAR was 6.67% and 7.41%, and the MPR was 20.00% and 22.22%, respectively; no significant differences were found between the two groups. Similarly, in the HRT group's different culture time layers, the IR was 21.92% and 21.74%, the CRP was 44.19% and 39.42%, the SAR was 21.05% and 11.11%, and the MPR was 12.28% and 14.81%, respectively; no statistically significant difference was found. In short-term layer, the outcomes of FET were not statistically different between the NC group and HRT group. Compared with the overnight layer of HRT group, IR and CPR were all higher than in the overnight layer of NC group (allP<0.05).Conclusion Endometrium prepared with NC protocol can obtain a better FET outcome than that of the HRT protocol, which mainly embodied in the selection of the thawed embryos'culture time in vitro before transplant, and culture overnight is appropriate.

embryo transfer; natural cycle; endometrial preparation; hormone replacement cycle

國家自然科學基金資助項目(81260109)；寧夏醫科大學總醫院特殊人才啟動項目(XT201421)；寧夏醫科大學重點實驗室

范曉玲(1975-),女，主治醫師，主要從事婦科生殖內分泌的研究。E-mail: fanxl19750108@163.com

簡介：胡蓉(1974-)，女，主任醫師，碩士研究生導師，主要從事婦科生殖內分泌的研究。E-mail: hr7424@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.002

713.7

A

1002-266X(2016)35-0005-04

2016-05-30)

項目(XY201404);寧夏自治區科技攻關項目(KF2010-49)。