miR-100對裸鼠食管鱗狀細胞癌移植瘤生長的影響

張乃鍵，蔣森，吳欽良，趙亞萍

(1中國人民解放軍第82醫院，江蘇淮安223001；2上海市東方醫院；3南京醫科大學附屬淮安市第一人民醫院)

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miR-100對裸鼠食管鱗狀細胞癌移植瘤生長的影響

張乃鍵1，蔣森2，吳欽良3，趙亞萍1

(1中國人民解放軍第82醫院，江蘇淮安223001；2上海市東方醫院；3南京醫科大學附屬淮安市第一人民醫院)

目的 觀察miR-100對裸鼠食管鱗狀細胞癌(ESCC)移植瘤生長的影響。方法 將人ESCC細胞株Kyse150皮下注射裸鼠腋部，成瘤后將瘤塊接種于21只裸鼠右側腋下；待腫瘤體積增至200 mm3左右時，將裸鼠隨機分為A、B、C組各7只，分別于瘤內注射50 μg/mL的miR-100-mimics、50 μg/mL的mimics-NC、轉染劑100 μL，1次/d，連續21 d。其間每隔1 d測量并記錄腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線；實驗結束后剝離腫瘤組織，稱量腫瘤質量。結果 干預后第5～7天B、C組腫瘤快速生長，且隨時間延長體積逐漸增大，與A組之間差異無統計學意義(P均>0.05)；而第9天后A組腫瘤生長受到抑制，腫瘤生長緩慢，幾乎停滯，體積明顯小于B、C組(P均<0.05)。干預后第21天，A組荷瘤裸鼠移植瘤質量為(0.115±0.087)g，明顯低于B組的(0.370±0.361)g和C組的(0.289±0.472)g，差異有統計學意義(P均<0.05)。結論 miR-100可以抑制ESCC裸鼠皮下移植瘤的生長。

食管癌；微小核糖核酸-100；Kyse150細胞；移植瘤；抑制作用；裸鼠

食管鱗狀細胞癌(ESCC)是食管癌的主要病理類型，以高發病率和地域差異的病死率為特征。微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA，其在癌癥發生和發展相關基因的調節中起重要作用。近來越來越多的研究證實，異常表達的miRNA可能在ESCC發病過程中起重要作用。本課題組前期研究發現，miRNA-100(miR-100)顯著低表達于ESCC癌組織，且與ESCC淋巴結轉移有關；體外研究結果表明，miR-100過表達可顯著抑制ESCC細胞遷移和侵襲，但對ESCC細胞增殖和凋亡均無明顯影響[1]。2012年3～6月，我們觀察了miR-100對裸鼠ESCC移植瘤的作用，探討miR-100參與ESCC的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人ESCC細胞株Kyse150購自美國模式培養物集存庫(ATCC)。BALB/c雌性裸小鼠30只，4～5周齡，體質量14～16 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司動物房。RPMI 1640培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，PBS、胰蛋白酶、臺盼藍染液均購自美國Invitrogen公司，DMSO購自美國Sigma公司；miR-100-mimics及相關的陰性對照(mimics-NC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司，動物體內轉染試劑(Entranster)購自北京Engreen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 Kyse150細胞用RPMI 1640培養基加10%胎牛血清，在37 ℃含5% CO2的細胞孵箱中培養。細胞每2～3 d換液1次，待細胞融合至80%～90%時，以胰蛋白酶消化液消化成單個細胞用于傳代，傳代比例為1∶3。 經數代培養后，待細胞處于對數生長期時收集細胞。

1.2.2 腫瘤細胞懸液制備 待細胞處于對數生長期時消化細胞，用吸管輕輕吹打，吸取100 μL細胞懸液至EP管內。加入100 μL臺盼藍染色液，輕輕吹打混勻，3～5 min后取20 μL滴板計數。于大方格內計數未被藍染的細胞總數，即為活細胞數。將剩余細胞懸液吸入10 mL離心管中，平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1 000 r/min離心5 min。棄上清液，依據臺盼藍染色計算的細胞濃度，加入適量不含血清的培養液，用滴管輕輕吹打細胞，制成濃度為5×107/mL的單細胞懸液。

1.2.3 ESCC動物模型建立 選擇體質量18～22 g、4～5周齡裸鼠9只，腋部皮下注射0.2 mL單細胞懸液。接種第2周開始成瘤，第3～4周后腫瘤長至200 mm3左右；選擇腫瘤生長旺盛荷瘤種鼠，剝離瘤塊。盡量剔除腫瘤壞死組織和帶血管的腫瘤間質，將瘤組織切成1.5～3.0 mm3的均勻小塊；將其接種于裸鼠右側腋下距腋窩1.5～2.0 cm處，接種21只。將裸鼠放回籠中繼續飼養，密切觀察動物狀態及腫瘤生長情況。第5天可見移植瘤塊生長，成瘤率100%。第20天前后腫瘤長至體積約100 mm3，提示建模成功。

1.2.4 動物分組及干預處理 待腫瘤體積增至200 mm3左右時，將21只裸鼠隨機分為A、B、C組各7只，分別于瘤內注射50 μg/mL的miR-100-mimics(5 μg miR-100+8 μL轉染劑+92 μL PBS)、50 μg/mL mimics-NC(5 μg mimic+8 μL轉染劑+92 μL PBS)、轉染劑(8 μL 轉染劑+92 μL PBS)100 μL；藥液注射瘤體的中心部位，并在腫瘤外周基底部分點注射。1次/d，連續21 d。

1.2.5 移植瘤體積及質量測定 給藥后每隔1 d測量瘤體積。腫瘤體積=1/2×長徑×短徑2，繪制腫瘤生長曲線。實驗結束后安樂死處死動物，剝離腫瘤組織并稱量。

2 結果

干預后第5～7天B、C組腫瘤快速生長，且隨時間的延長體積逐漸增大，與A組之間差異無統計學意義(P均>0.05)。而第9天后A組腫瘤生長受到抑制，腫瘤生長緩慢，幾乎停滯，體積明顯小于B、C組(P均<0.05)。見表1。干預后第21天，A組荷瘤裸鼠移植瘤質量為(0.115±0.087)g，明顯低于B組的(0.370±0.361)g和C組的(0.289±0.472)g，差異有統計學意義(P均<0.05)。

表1 各組荷瘤裸鼠移植瘤體積比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

我國是世界食管癌高發區域之一，組織類型主要為ESCC[2]，其發病呈現明顯的地域分布特征，全國共有7個高發區，江蘇北部地區即是其中之一[3]。盡管食管癌手術水平不斷提高，放療化療設備及藥物不斷更新，但手術患者術后5年生存率僅為20%[4]。大量文獻報道，許多miRNA參與了對腫瘤發生機制的調控，起到抑癌或致癌基因的作用。近年來，高通量檢測發現多種miRNA在食管癌組織中異常表達[5～9]，且與腫瘤的發生、發展關系密切。

miR-100位于人類基因組11q24.1中，進化上高度保守，在果蠅、鮐、鼠及猩猩等近100種動物中均存在表達，提示其在生命活動中的重要功能。miR-100的靶基因功能主要涉及基因沉默、負性調節細胞的生物合成等生物學過程，涉及腫瘤信號通路、凋亡信號通路等。研究發現，miR-100參與多種人類腫瘤的發生機制。目前已有報道稱，miR-100在不同腫瘤中的表達與作用并不一致，為此很多學者對miR-100進行了深入研究。Li等[10]發現，miR-100低表達于不同等級的宮頸上皮內瘤樣病變及宮頸癌中，體外研究表明miR-100可抑制宮頸癌細胞生長；體內實驗發現，miR-100與保羅樣激酶1(PLK1)蛋白表達呈負相關，該關系在宮頸癌中更明顯，表明miR-100與PLK1在宮頸癌的發展中起重要作用。根據實體腫瘤具有低氧的特性，Blick等[11]研究發現，在低氧情況下，膀胱癌細胞內miR-100表達下調；體外miR-100過表達會導致下游磷酸化的促有絲分裂信號蛋白MAPK和PKB激酶減少，進而抑制細胞的有絲分裂，表明miR-100抑制膀胱癌的發生。Akbari等[12]研究證實，miR-100或miR-99a受到miR-125b的協同作用抑制下游相關基因，共同促發兒童急性淋巴細胞白血病的長春新堿抵抗，起到致癌基因的作用。可見，miR-100在不同腫瘤類型、不同環境影響下作用各異。因此，miR-100調控關系網絡復雜、生物學功能及調控機制尚不十分清楚。

本實驗基于前期研究，觀察了miR-100對ESCC裸鼠移植瘤生長的影響。結果顯示，miR-100對裸鼠皮下移植瘤的生長抑制作用明顯，于治療第9天開始腫瘤的體積顯著減小，且隨治療時間的延長，抑制作用仍然較佳。表明miR-100過表達能快速有效地抑制腫瘤在體內的增殖，雖然前期體外研究結果顯示miR-100對ESCC細胞增殖和凋亡均無明顯影響。但由于miRNA在體內的作用機制復雜，通常一個miRNA可以調控多個基因的功能，而同一基因又受多個miRNA的特異調控，復雜的調控網絡可能放大了miR-100的抑瘤作用。然而，目前miR-100的復雜關系網絡研究還不成熟，其調控機制還需進一步研究。

[1] Zhang N, Fu H, Song L, et al. MicroRNA-100 promotes migration and invasion through mammalian target of rapamycin in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncol Rep, 2014,32(4):1409-1408.

[2] Zhang W, Bailey-Wilson JE, Li W, et al. Segregation analysis of esophageal cancer in a moderately high-incidence area of northern China[J]. Am J Hum Genet, 2000,67 (1):110-119.

[3] 皺小農.食管癌流行病學[J].中華腫瘤防治雜志,2006,13(8):181-184.

[4] Fang Y, Fang D, Hu J. MicroRNA and its roles in esophageal cancer[J]. Med Sci Mon, 2012,18(3):22-30.

[5] Ni Y, Meng L, Wang L, et al. MicroRNA-143 functions as a tumor suppressor in human esophageal squamous cell carcinoma[J]. Gene, 2013,517(2):197-204.

[6] Yokobori T, Suzuki S, Tanaka N, et al. MiR-150 is associated with poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma via targeting the EMT inducer ZEB1[J]. Cancer Sci, 2013,104(1):48-54.

[7] Wang XC, Zhang ZB, Wang YY, et al. Increased miRNA-22 expression sensitizes esophageal squamous cell carcinoma to irradiation[J]. J Radiat Res, 2013,54(3):401-408.

[8] Wang T, Chen T, Niu H, et al. MicroRNA-218 inhibits the proliferation and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma cells by targeting BMI1[J]. Int J Mol Med, 2015,36(1):93-102.

[9] Song Y, Li J, Zhu Y, et al. MicroRNA-9 promotes tumor metastasis via repressing E-cadherin in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2014,5(22):11669-11680.

[10] Li BH, Zhou JS, Ye F, et al. Reduced miR-100 expression in cervical cancer and precusors and its carainogenic effect through targeting PLK1 protein[J]. Eur J Cancer, 2011,47(14):2166-2174.

[11] Blick C, Ramachandran A, Wigfield S, et al. Hypoxia regulates FGFR3 expression via HIF-lalpha and miR-100 and contributes to cell surival in non-muscle invasive bladder cancer[J]. Br J Cancer, 2013,109(1):50-59.

[12] Akbari MF, Lange-Turenhout EA, Aries IM, et al. MiR-125b,miR-100 and miR-99a co-regulate vincstance in childhood acute lymphoblastic leukemia[J]. Leuk Res, 2013,37(10):1315-1321.

江蘇省自然科學基金資助項目(BK2012666)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.011

R735.1

A

1002-266X(2016)38-0035-03

2015-11-20)