miRNA-21對脂多糖誘導大鼠心肌細胞增殖的影響及其機制探討

王圓,黃燕,楊丹英,姜虹

(1上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院,上海200011；2上海交通大學醫學院附屬新華醫院)

?

miRNA-21對脂多糖誘導大鼠心肌細胞增殖的影響及其機制探討

王圓1,黃燕1,楊丹英2,姜虹1

(1上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院,上海200011；2上海交通大學醫學院附屬新華醫院)

目的 觀察微小RNA-21(miRNA-21)對脂多糖(LPS)誘導的大鼠心肌細胞增殖的影響，并探討其可能機制。方法 取大鼠心肌細胞H9C2，用LPS 10 μg/mL處理0、6、12 h，RT-PCR法檢測細胞miRNA-21表達。將對數生長期的H9C2細胞隨機分為4組，A組不處理，B組用LPS 10 μg/mL處理12 h；C、D組分別轉染對照質粒(NCmiRNA片段)、miRNA-21抑制質粒(miRNA-21 antagomiR)，培養48 h后再用LPS 10 μg/mL處理12 h。 采用CCK-8法檢測各組H9C2細胞增殖的OD值，Western blot法檢測H9C2細胞中Bax、Bcl-2蛋白，分光光度法檢測H9C2細胞中Caspase-3活性。結果 LPS處理0、6、12 h時，H9C2細胞miRNA-21相對表達量分別為1.05±0.03、12.95±0.08、19.62±0.12；與0 h時比較，6、12 h時H9C2細胞miRNA-21相對表達量升高(P均<0.01)。A、B、C、D組H9C2細胞增殖的OD值分別為1.08±0.03、0.71±0.03、0.70±0.01、0.85±0.02，A組﹥D組﹥B、C組，P均﹤0.01。與A組比較，B、C、D組H9C2細胞中Bax相對表達量增加、Bcl-2相對表達量降低(P均﹤0.01)；與B、C組比較，D組H9C2細胞中Bax相對表達量減少、Bcl-2相對表達量增加(P均﹤0.01)。B、C、D組H9C2細胞Caspase-3活性分別為1.13±0.08、1.10±0.14、0.57±0.06，D組H9C2細胞Caspase-3活性低于B、C組，P均﹤0.01。結論 LPS可致心肌細胞損害過程miRNA-21表達增加，抑制miRNA-21表達可減輕LPS對心肌細胞增殖的抑制作用；其機制為抑制miRNA-21表達可下調Bax蛋白、上調Bcl-2蛋白表達，抑制Caspase-3活性，從而減輕細胞凋亡。

微小核糖核酸21；脂多糖；心肌細胞；細胞增殖；凋亡相關蛋白；膿毒血癥；大鼠

膿毒血癥作為由各類致病微生物在體內積聚導致機體出現炎性狀態的全身炎癥反應綜合征(SIRS)，若未進行及時治療則會出現多器官功能衰竭，危及生命，影響預后[1,2]。而心肌損傷是膿毒血癥及膿毒性休克時最危險的并發癥，嚴重影響心臟功能，其造成的難治性低血壓是膿毒血癥死亡的重要因素。因此，預防和治療心肌損傷成為膿毒血癥治療的重要組成部分[3]。微小RNA(miRNA)是一種存在于真核生物中長度約為22個核苷酸大小的非編碼單鏈小分子RNA，可特異性識別目的mRNA的3′非編碼區(3′UTR)并與之結合，從而降解目的mRNA或抑制翻譯，調節重要的細胞活動，參與眾多疾病的病理生理過程[4]。研究表明，miRNA廣泛參與人體生長發育、免疫應答及炎癥反應等生理過程，并且參與心血管疾病、腫瘤和感染等疾病調控過程[5～7]。miRNA-21已被證實參與缺血再灌注、心臟肥大等心臟疾病調控[8,9]。但是，目前涉及miRNA-21與膿毒血癥心肌損傷之間的研究甚少。2015年4月～2016年3月，我們觀察了miRNA-21對脂多糖(LPS)誘導的心肌細胞增殖的影響，并探討其可能的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠胚胎心肌細胞 H9C2購自中國科學院上海細胞庫;DMEM、胎牛血清(FBS)、0.05%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、Hanks液均購自美國Gibco公司；TRIzol、Lipofectamine2000轉染試劑、焦碳酸二乙酯 (DEPC)水購自美國Invitrogen公司；miRNA-21抑制質粒(miRNA-21 antagomiR)購自廣州瑞博公司；miScript Reverse Transcription Kit購自荷蘭Qiagen公司；PCR試劑盒購自美國Life公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司；酶標儀ECX800購自美國Bio-TEX公司；Bax、Bcl-2、Caspase-3檢測試劑盒購自南京凱基公司；CCK-8細胞計數試劑盒購自日本同仁化學研究所；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將H9C2細胞置于含10%FBS的DMEM(高糖)培養基中，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。當細胞鋪滿培養皿時，用1～2 mL PBS沖洗2遍；加1 mL胰酶消化1 min，再加含10%血清培養液終止消化。將細胞懸液移至15 mL離心管，500 g離心3 min；倒去上清，將細胞稀釋后按1∶3的比例分到新皿。

1.2.2 H9C2細胞miRNA-21檢測 取對數生長期的H9C2細胞，分別于LPS 10 μg/mL處理0、6、12 h時收集細胞，采用RT-PCR法檢測miRNA-21。按產品說明書用TRIzol裂解細胞，氯仿抽提細胞總RNA。逆轉錄反應合成模板cDNA，-20 ℃保存。以20 μL反應體系進行PCR，取2 μL逆轉錄反應產物分別與miR-21引物和內參照U6引物進行反應。miR-21引物序列:上游5′-CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3′，下游5′-GACTGTGACGACTACCCCAA-3′；U6引物序列：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40次。在ABI 7300 PCR System上操作反應，采用2-ΔΔCt法計算目的基因與內參照的比值，以此表示目的基因相對表達量。

1.2.3 H9C2細胞增殖活性觀察 采用CCK-8法。將細胞制成單細胞懸液，以1×105/孔接種至6孔板。當細胞生長融合達60%～70%后，隨機分為4組。A組不處理，B組用LPS 10 μg/mL處理12 h；C、D組分別以Lipofectamine2000轉染對照質粒(NCmiRNA片段)、miRNA-21抑制質粒(miRNA-21 antagomiR)，在37 ℃，5%CO2的孵箱中培養48 h后再用LPS 10 μg/mL處理12 h。 每孔加CCK-8試劑，繼續培養4 h，用酶標儀測490 nm的光密度(OD)值。

1.2.4 H9C2細胞Bax、Bcl-2蛋白檢測 采用Western blot法。取1.2.3中各組細胞，用含有10%磷酸酶抑制劑和1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的細胞裂解液裂解細胞。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒進行蛋白定量，15%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫下封閉4 h，4 ℃孵育一抗Bax、Bcl-2、GAPDH過夜。TBST洗滌3次，每次15 min。室溫下孵育二抗1～2 h，TBST洗滌3次，每次15 min。Image Quant LAS4000mini顯影，以目的蛋白與GAPDH蛋白條帶OD比值表示目的蛋白相對表達量。

1.2.5 H9C2細胞Caspase-3活性測定 采用分光光度法。取1.2.3中各組細胞，用胰酶消化；4 ℃下2 000 g離心5 min，收集細胞；吸除上清，PBS洗滌1次。吸盡上清后，按照每2×107個細胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。4 ℃下16 000 g離心15 min，把上清轉移到冰浴預冷的離心管中。按照試劑盒的說明檢測Caspase-3活性。在酶標儀上測定波長在405 nm處的OD405值，以各組與A組OD比值表示Caspase-3活性。

2 結果

2.1 LPS對H9C2細胞miRNA-21表達的影響 LPS處理0、6、12 h時，H9C2細胞miRNA-21相對表達量分別為1.05±0.03、12.95±0.08、19.62±0.12；與0 h時比較，6、12 h時H9C2細胞miRNA-21相對表達量均升高(P均<0.01)。

2.2 抑制miRNA-21表達對LPS誘導H9C2細胞增殖的影響 A、B、C、D組H9C2細胞增殖的OD值分別為1.08±0.03、0.71±0.03、0.70±0.01、0.85±0.02，A組﹥D組﹥B、C組，P均﹤0.01。

2.3 抑制miRNA-21表達對LPS誘導H9C2細胞Bax、Bcl-2表達的影響 結果顯示，LPS能夠顯著上調Bax表達，并下調 Bcl-2表達；miRNA-21抑制劑顯著下調Bax表達，并上調Bcl-2表達。見表1。

表1 各組H9C2細胞Bax、Bcl-2蛋白 相對表達量比較±s)

注：與A組比較，*P均﹤0.01；與D組比較，#P均﹤0.01。

2.4 抑制miRNA-21表達對LPS誘導H9C2細胞Caspase-3活性的影響 結果顯示，B、C、D組H9C2細胞Caspase-3活性分別為1.13±0.08、1.10±0.14、0.57±0.06,D組H9C2細胞Caspase-3活性性低于B、C組，P均﹤0.01。

3 討論

在重癥監護室中，心肌損傷目前已經成為膿毒血癥死亡的最主要原因[10]。在膿毒癥發生過程中，LPS被公認是一種致病因子。在LPS引起的心肌損害中，主要表現為細胞壞死和細胞凋亡兩種形式。其中，細胞凋亡發生較早，是早期心肌細胞損傷的主要形式；抑制心肌細胞凋亡，將有助于改善心肌損害、恢復心臟功能[11]。

miRNA參與人類細胞30%～40%基因表達的調節，其可與靶基因mRNA互補結合，通過促進目的基因mRNA降解或抑制其翻譯而負性調節靶基因表達，是基因表達調控的一個重要環節[12]。近期研究顯示，miRNA-21在多種缺血缺氧性心血管疾病(如冠心病、心肌梗死等)中表達異常，并在疾病發生發展中發揮重要作用[9]。目前，miRNA-21被認為是一種能發揮抗凋亡作用的miRNA，在多種腫瘤細胞及過氧化氫所致心肌細胞氧化損傷中均表現出明顯的抗凋亡效應[6, 13]。Cheng等[8]在缺血再灌注細胞模型中證實，降低miRNA-21表達水平可減少心肌細胞凋亡。本研究對體外培養的心肌細胞H9C2給予LPS刺激，結果顯示刺激6、24 h時細胞miRNA-21表達均明顯上升，提示miRNA-21可能參與膿毒血癥所致的心肌細胞損害過程。

細胞凋亡是基因控制的細胞自主性死亡過程，它是在基因調控下的一個嚴密完整的程序過程。其中，Caspase家族在凋亡過程中起到非常重要的作用，是細胞形態學和生物學改變的關鍵執行者[14]。在本實驗中，LPS刺激24 h后心肌細胞增殖能力降低，預先轉染miRNA-21抑制劑可明顯提高細胞增殖活性。Western blot法檢測結果顯示， LPS刺激24 h后心肌細胞凋亡蛋白Bax表達升高，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達下降；預先轉染miRNA-21較LPS刺激組及陰性對照組可使凋亡蛋白Bax表達顯著下降，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達顯著上升。Caspase-3的活性實驗亦證明如此，進一步說明miRNA-21參與LPS所致心肌細胞損害過程。其機制可能是通過轉染miRNA- 21抑制劑降低miRNA-21水平，從而抑制LPS所致的細胞凋亡，從而增加細胞增殖活力。

本研究加深了對LPS所致心肌細胞損傷機制的了解，然而，miRNA-21作為重要的調節因子，在機體嚴重膿毒血癥心肌損害中是否發揮保護作用，仍有待進一步深入探索。

[1] Arshad S, Mumtaz A, Ahmad F, et al. Mi-discoverer: A bioinformatics tool for the detection of mi-RNA in human genome[J]. Bioinformation, 2010,5(6):271-276.

[2] Kanwal N, John P, Bhatti A. MicroRNA-155 as a therapeutic target for inflammatory diseases[J]. Rheumatol Int, 2013,33(3):557-560.

[3] Hobai IA, Edgecomb J, Labarge K, et al. Dysregulation of intracellular calcium transporters in animal models of sepsis-induced cardiomyopathy[J]. Shock, 2015,43(1):3-15.

[4] van Rooij E. The art of microRNA research[J]. Circ Res, 2011,108(2):219-234.

[5] Suarez Y, Fernandez-Hernando C, Pober JS, et al. Dicer dependent microRNAs regulate gene expression and functions in human endothelial cells[J]. Circ Res, 2007,100(8):1164-1173.

[6] Pan X, Wang ZX, Wang R. MicroRNA-21: a novel therapeutic target in human cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2010,10(12):1224-1232.

[7] Roderburg C, Luedde M, Vargas Cardenas D, et al. Circulating microRNA-150 serum levels predict survival in patients with critical illness and sepsis[J]. PLoS One, 2013,8(1):e54612.

[8] Cheng Y, Zhu P, Yang J, et al. Ischaemic preconditioning-regulated miR-21 protects heart against ischaemia/reperfusion injury via anti-apoptosis through its target PDCD4[J]. Cardiovasc Res, 2010,87(3):431-439.

[9] Cheng Y, Zhang C. MicroRNA-21 in cardiovascular disease[J]. J Cardiovasc Transl Res, 2010,3(3):251-255.

[10] Romero-Bermejo FJ, Ruiz-Bailen M, Gil-Cebrian J, et al. Sepsis-induced cardiomyopathy[J]. Curr Cardiol Rev, 2011,7(3):163-183.

[11] Zaky A, Deem S, Bendjelid K, et al. Characterization of cardiac dysfunction in sepsis: an ongoing challenge[J]. Shock, 2014,41(1):12-24.

[12] Friedman RC, Farh KK, Burge CB, et al. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs[J]. Genome Res, 2009,19(1):92-105.

[13] Cheng Y, Liu X, Zhang S, et al. MicroRNA-21 protects against the H(2)O(2)-induced injury on cardiac myocytes via its target gene PDCD4[J]. J Mol Cell Cardiol, 2009,47(1):5-14.

[14] Rupinder SK, Gurpreet AK, Manjeet S. Cell suicide and caspases [J]. Vascul Pharmacol, 2007,46(6):383-393.

上海交通大學醫學院課題項目(JY2011A10)；上海市長寧區衛生局資助項目(20104Y01001)。

姜虹(E-mail: 17897562@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.009

R459.7

A

1002-266X(2016)38-0029-03

2016-05-18)