1-磷酸鞘氨醇對肺泡Ⅱ型上皮細胞上皮間質轉化的影響

彭秋月，張曉萍， 邵潤霞

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450014)

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1-磷酸鞘氨醇對肺泡Ⅱ型上皮細胞上皮間質轉化的影響

彭秋月，張曉萍， 邵潤霞

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州450014)

目的 觀察1-磷酸鞘氨醇(S1P)對肺泡Ⅱ型上皮細胞發生上皮間質轉化(EMT)的影響。方法 體外培養肺泡Ⅱ型上皮細胞A549，以不同濃度(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)S1P作用72 h后,倒置顯微鏡觀察細胞形態變化；以10-5mol/L S1P作用A549細胞，不同時點(0、12、24、48、72 h)收集細胞，采用Western blot法和RT-PCR法分別測定EMT相關蛋白及mRNA。以0 mol/L S1P或S1P作用0 h為對照組，其他濃度和時點為觀察組。結果 觀察組不同濃度S1P孵育后，A549細胞在10-7mol/L時，開始出現類似成纖維細胞形態學改變，細胞呈梭形、紡錘形，且細胞間連接疏松，間隙增大；對照組細胞呈典型的上皮細胞形態，細胞間連接緊密，呈類圓形。與對照組相比，觀察組隨著作用時間的延長，上皮標記物E-鈣黏素蛋白及mRNA表達下調，間質標記蛋白纖維連接蛋白、平滑肌肌動蛋白及mRNA表達上調，均在作用48、72 h差異具有統計學意義(P均<0.05或0.01)。結論 S1P分子可誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞發生EMT，在肺間質纖維化形成過程中具有一定促進作用。

肺間質纖維化；上皮間質轉化；1-磷酸鞘氨醇；肺泡Ⅱ型上皮細胞；E-鈣黏素；纖維連接蛋白；平滑肌肌動蛋白

肺間質纖維化是一種慢性炎癥性間質性肺疾病，主要表現為彌漫性肺泡炎、肺泡單位結構紊亂。病理改變以大量的成纖維細胞聚集、細胞外基質沉積，并伴有炎癥和組織損傷所致的結構破壞為特征；早期各種細胞因子滲出、大量炎性細胞浸潤，后期成纖維細胞大量增生、膠原沉積，并逐漸發展為不可逆的病理過程[1]。肺間質纖維化發病率逐漸升高，但具體發病機制尚不完全明確。近年研究發現，Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷與不適當的修復可啟動上皮間質轉化(EMT)，使上皮標記物E-鈣黏素(E-cad)表達下調、間質標記蛋白纖維連接蛋白(FN)和平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達上調，從而促進肺間質纖維化的發生與發展[2]。然而，目前并無有效的治療方案阻止持續進展的EMT過程。

1-磷酸鞘胺醇(S1P)是一種具有重要生理功能的膜磷脂代謝產物，S1P通過與受體結合或直接作為第二信使，介導細胞的增殖、凋亡、遷移、細胞分化等多種生物學作用[3]。研究發現，S1P可調控多種細胞參與纖維炎癥及纖維化過程[4]。2015年3月～2016年5月，我們觀察了S1P對肺泡Ⅱ型上皮細胞EMT的影響，探討S1P在肺間質纖維化發病機制中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 肺泡Ⅱ型上皮細胞A549(鄭州大學基礎醫學院提供)；DMEM高糖培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)，胰酶、PBS (美國HyClone公司)，二甲基亞砜、S1P(美國Sigma公司)；TRIzol Reagent (美國Invitrogen公司)，DNA反轉錄試劑盒、SYBR Ⅰ Real time PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；抗FN、α-SMA、E-cad一抗(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗(北京博奧森生物技術有限公司)。倒置顯微鏡(美國Leica公司)，ABI 7500Fast 實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，垂直電泳儀、電泳槽、轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將A549細胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL慶大霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養基培養，置于37 ℃、5% CO2人工培養箱中，隔天換液。待細胞培養至70%～80%融合狀態時，用0.25%胰酶消化傳代培養。

1.2.2 細胞形態觀察 調整消化傳代的細胞密度為1.0×106/mL，接種于6孔板內，待細胞貼壁生長融合達70%～80%時，無血清靜止培養24 h；加入不同濃度(0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)S1P作用48 h后，使用倒置顯微鏡觀察細胞形態變化并拍照。將0 mol/L S1P設為對照組，其他濃度設為觀察組。

1.2.3 EMT相關蛋白及基因檢測 調整消化傳代的細胞密度為1.0×106/mL，接種于6孔板內；待細胞貼壁生長融合達70%～80%時，無血清靜止培養24 h；加入10-5mol/L的S1P，收集作用0、12、24、48、72 h時的細胞。將0 h設為對照組，其他時點設為觀察組。每次試驗重復3次。①E-cad、FN、α-SMA蛋白檢測：采用Western blot法。取10-5mol/L的S1P干預后呈對數生長的A549細胞，分別于0、12、24、48 h提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度并調整每孔蛋白上樣量為30 μg。蛋白樣品和上樣緩沖液按比例混勻變性后電泳，轉膜、封閉；相應的一抗(按1∶250稀釋)4 ℃孵育過夜，HRP標記二抗(按1∶500稀釋)室溫孵育2 h,洗膜后進行ECL顯色，用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的積分光密度值。以目的蛋白與GAPDH積分光密度比值作為目的蛋白相對表達量。②E-cad、FN、α-SMA mRNA檢測：采用RT-PCR法。收集各個時間點細胞,利用TRIzol提取細胞總RNA；定量后取總RNA 1 μg，按照cDNA合成試劑盒說明書反轉錄合成cDNA；以其為模板，利用ABI7500 Fast System進行熒光定量PCR反應；以GAPDH作為內參基因，每組設3個復孔。引物序列：α-SMA上游引物為5′-AAAGCAAGTCCTCCAGCGT-3′，下游引物為5′-TTAGTCCCGGGGATAGGCAA-3′；FN上游引物為5′-GCTGACAGAGAAGATTCCCGA-3′，下游引物為5′-CCAGGGTGATGCTTGGAGAA-3′；E-cad上游引物為5′-GGCTGGACCGAGAGAGTTTC-3′，下游引物為5′-TCAAAATCCAAGCCCGTGGTG-3′。GAPDH上游引物為5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，下游引物為5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。反應條件:95 ℃變性30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s,循環40次；末次循環后做溶解曲線，條件為95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。以與內參基因的比值表示目的基因的相對表達量，并采用2-ΔΔCT法來分析各組目的基因的表達差異。

2 結果

2.1 不同濃度S1P對A549細胞形態的影響 對照組細胞呈典型的上皮細胞形態，細胞間連接緊密，呈類圓形。觀察組不同濃度S1P孵育后，A549細胞在10-7mol/L時開始出現類似成纖維細胞形態學改變，細胞呈梭形、紡錘形，且細胞間連接疏松，間隙增大。

2.2 S1P對A549細胞E-cad、FN、α-SMA蛋白表達的影響 觀察組SIP處理細胞48、72 h后明顯上調FN蛋白的表達(t=2.093，P<0.05；t=2.787，P<0.01)，且明顯上調α-SMA蛋白的表達(t=3.344、3.965，P均<0.01)，但明顯抑制E-cad蛋白的表達(t=2.112，P<0.05；t=2.939，P<0.01)。見表1。

表1 兩組A549細胞E-cad、FN、α-SMA蛋白 相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P﹤0.05，#P﹤0.01。

2.3 S1P對A549細胞E-cad、FN、α-SMA mRNA表達的影響 觀察組S1P處理細胞48、72 h后明顯上調FN mRNA表達(t=2.688，P<0.05；t=3.156，P<0.01)，且明顯上調α-SMA mRNA表達(t=2.274，P<0.05；t=4.202，P<0.01)，但是E-cad mRNA表達明顯下調(t=3.223，P<0.05；t=3.459，P<0.01)。見表2。

表2 兩組A549細胞E-cad、FN、α-SMA mRNA 相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P﹤0.05，#P﹤0.01。

3 討論

由于肺間質纖維化缺乏特異性診斷且呈持續進展的特點，不斷給臨床工作者帶來挑戰[5]。各種不同的病因均可導致肺間質纖維化，其機制主要是多種炎性細胞及炎癥介質參與的炎癥損傷及纖維增生修復，最終導致不可逆的損傷[6]，早期肺泡炎癥、晚期細胞外基質沉積是最關鍵的步驟[7]。而此過程中，肌成纖維細胞的積聚及持續存在被認為是導致纖維化進展的主要原因，而FN、α-SMA、E-cad被認為是纖維化發生過程中經典的標記蛋白[8]。除了間質中殘存的成纖維細胞，肺泡上皮可通過相應EMT發展為具有收縮能力的肌成纖維細胞[9]。EMT是充分分化的上皮細胞經過表型改變轉化為成熟的間質細胞(主要包括成纖維細胞和纖維母細胞)[10]，而A549細胞是肺泡Ⅱ型上皮細胞起源的細胞系,是研究EMT良好的細胞模型[8]。

S1P是具有生物活性的脂類，且被證實是肺促纖維化及重塑的一個因子。因為在博來霉素介導的肺纖維化動物模型及特發性肺纖維化患者的支氣管肺泡灌洗液中,S1P水平較正常組明顯增加[11]。S1P主要是通過G-蛋白偶聯受體S1P受體家族，主要包括S1P1、S1P2、S1P3來介導生物學效應[12]。研究發現，促纖維化因子TGF-β1活化及上調鞘氨醇激酶1(SPHK1),而這種酶可以使鞘氨醇磷酸化，進而產生S1P[13]；S1P通過與相應受體作用，又可以反過來促進TGF-β1表達上調，這種正反饋調節放大了S1P的促EMT作用[9]。

S1P具有類似經典促纖維化因子TGF-β1的生物學效應，且與其之間形成反饋回路。基于這個研究背景，我們推論S1P也可能具有促進肺泡上皮細胞發生EMT的作用。最近國外研究發現，S1P可以介導視黃醛色素細胞發生EMT[11]。但是，國內尚沒有發現足量資料來證明S1P可以作用肺泡上皮細胞。因此，本研究首先從形態學定性地觀察S1P的生物學作用。結果顯示，未經S1P處理的細胞呈典型的上皮細胞形態，細胞間連接緊密，呈類圓形；而經S1P處理后，10-7mol/L的S1P刺激下肺泡Ⅱ型上皮細胞就開始向纖維化細胞轉變，細胞明顯拉長，呈梭形，鵝卵石樣改變，細胞疏松，連接減少。發現細胞形態學改變之后，接著從蛋白和基因表達的層面定量分析標記蛋白的變化。E-cad是一種跨膜蛋白，對維持上皮結構完整性至關重要；它的下調會導致相鄰細胞連接減少，進而細胞連接變疏松[14]。FN、α-SMA是間質細胞表型中經典的標記蛋白，如果在上皮細胞的表型中檢測到這些蛋白的表達，可以證明上皮細胞已經向間質細胞轉化。本實驗中，S1P(10-5mol/L)處理細胞后，隨著時間的延長，間質型標記蛋白FN、α-SMA表達上調，而同時上皮標記蛋白E-cad表達下調，48、72 h時與對照組相比，表達具有顯著性差異，證實S1P可以促進肺泡上皮細胞發生EMT。

總之，我們通過形態學及分子表型標記蛋白的動態變化，初步探索了S1P分子參與肺泡上皮細胞的EMT過程，進而為研究S1P介導肺間質纖維化的發生發展奠定基礎，但具體的調控機制及通路還需要進一步探討。阻斷相關通路下游信號分子，有可能為肺間質纖維化的治療提供新的靶點及思路。

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Influence of S1P on epithelial-mesenchymal transition of alveolar type II epithelial cells

PENGQiuyue,ZHANGXiaoping,SHAORunxia

(TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

Objective To observe the effect of sphingosine-1-phosphate (S1P) on epithelial-myofibroblast transition (EMT) of alveolar type Ⅱepithelial cells.Methods A549 cells were exposed to different concentrations of methanol-insolube S1P (0, 10-8, 10-7, 10-6and 10-5mol/L) for 72 hours, then the morphology was observe by inverted microscope. A549 cells were also treated with S1P (10-5mol/L) at different time points (0, 12, 24, 48 and 72 h), then the involved protein and mRNA expression was detected by Western blotting and RT-PCR, respectively. Meanwhile, we set S1P (0 mol/L, 0 h) as the control group and took other concentrations and other time points as the observation groups.Results For the observation groups, morphological changes in A549 cells began at the concentration of 10-7mol/L, which induced more fibroblast-like morphology with loosened cell-cell connection. For the control group, it represented typical epithelial oval morphology with tightly cell-cell connection. The expression of E-cadherin (protein and mRNA) significantly decreased, and the expression of α-SMA, fibronectin (FN) (protein and mRNA) significantly increased in A549 cells treated with S1P for 48, 72 h as compared with that of the control group (allP<0.05, or allP<0.01), which was in a time-dependent manner.Conclusion S1P may induce the EMT of alveolar type Ⅱ cells and plays an important role in the formation of pulmonary interstitial fibrosis.

pulmonary interstitial fibrosis; epithelial-mesenchymal transition; sphingosine-1-phosphate; alveolar type Ⅱ cells; E-cadherin; fibronectin; a-smooth muscle actin

彭秋月(1991-)，女，碩士在讀，主要研究方向為間質性肺疾病。E-mail: 308875754@qq.com

簡介：邵潤霞(1964-)，女，教授，碩士生導師，主要研究方向為間質性肺疾病。E-mail: shaorunxia@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.002

R563.9

A

1002-266X(2016)38-0005-04

2015-05-31)