山楂葉總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸組織病變的改善作用

闞敏宸

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056008)

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山楂葉總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸組織病變的改善作用

闞敏宸

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056008)

目的 研究山楂葉總黃酮(HLF)對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸組織病變的改善作用。方法 將80只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和HLF低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組，每組16只；除正常組外,其他各組均采用高脂高糖飲食8周后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法制備2型糖尿病大鼠模型；之后正常組、模型組灌胃生理鹽水，HLF各組灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)6周。干預(yù)結(jié)束后，測(cè)定各組大鼠空腹血糖水平，稱量體質(zhì)量并計(jì)算睪丸指數(shù)，測(cè)定血清睪酮以及睪丸組織中酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)含量；HE染色觀察睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，透射電鏡觀察睪丸組織超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果 與模型組比較，HLF中、高劑量組大鼠空腹血糖水平均顯著降低，體質(zhì)量及睪丸指數(shù)均顯著升高，血清睪酮以及睪丸組織中ACP、LDH、γ-GT水平均顯著上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。HE染色后光鏡下可見(jiàn)模型組大鼠睪丸曲細(xì)精管萎縮、生精細(xì)胞脫落且數(shù)量顯著減少等病理改變，而HLF各組睪丸組織病變呈不同程度改善，以HLF高劑量組效果最顯著；電鏡下可見(jiàn)模型組睪丸組織胞體縮小、細(xì)胞器減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脂滴形成、細(xì)胞核固縮、等病理改變，而HLF各組睪丸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變明顯改善，以HLF高劑量組最為顯著。結(jié)論 HLF對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸組織病變具有一定的改善作用。

山楂葉總黃酮；糖尿病；睪丸；大鼠

Key words: Hawthorn Leaves Flavonoids; diabetes mellitus; testis; rat

睪丸病變是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，發(fā)病率是非糖尿病患者的10倍以上[1]，嚴(yán)重影響著糖尿病患者的生活質(zhì)量和生命健康。山楂葉為我國(guó)傳統(tǒng)中藥品種，在《本草經(jīng)疏》及《本草通玄》等典籍中均有記載；山楂葉總黃酮(Hawthorn leaves flavonoids，HLF)是從山楂葉中提取的一類黃酮類化合物，以往研究表明其具有抗氧化、降血脂等多種生物學(xué)活性[2]以及保護(hù)2型糖尿病大鼠胰腺組織和腦組織等藥理學(xué)作用[3-4]，但其是否對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸組織具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察了HLF對(duì)2型糖尿病大鼠睪丸組織病變的改善作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 藥物與試劑 HLF(長(zhǎng)春三九生物制藥，批號(hào)：20140213)；酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)以及睪酮檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；HE檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物工程有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，7周齡，體質(zhì)量180～220g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003，動(dòng)物合格證號(hào)：1503008。

1.3 方法 將80只實(shí)驗(yàn)用SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組以及HLF低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組，每組16只；除正常組外，其余各組大鼠經(jīng)高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，行腹腔注射STZ(60 mg/kg)破壞胰島β細(xì)胞以制備糖尿病大鼠模型，24 h和72 h后分別檢測(cè)空腹血糖水平穩(wěn)定在16.7 mmol/L以上即認(rèn)定為造模成功。HLF各劑量組分別灌胃給予相應(yīng)劑量HLF，每天1次，連續(xù)6 周；模型組和正常組同步給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.4 觀察項(xiàng)目

1.4.1 空腹血糖水平、體質(zhì)量及睪丸指數(shù) 干預(yù)結(jié)束后，由尾靜脈取血以測(cè)定各組大鼠空腹血糖水平并記錄；稱量各組大鼠體質(zhì)量，麻醉后取睪丸組織沖洗干凈并用濾紙拭干后稱質(zhì)量，以計(jì)算睪丸指數(shù)：睪丸指數(shù)(%)=(睪丸質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。

1.4.2 血清睪酮含量 麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并離心取血清，參照試劑盒操作步驟，通過(guò)放射免疫法平行測(cè)定各組大鼠血清中睪酮含量。

1.4.3 睪丸組織中ACP、LDH、γ-GT水平 取每組其中8只大鼠的睪丸組織，按照各試劑盒操作方法步驟進(jìn)行處理，然后通過(guò)酶標(biāo)儀平行測(cè)定各組大鼠睪丸組織中ACP、LDH、γ-GT水平。

1.4.4 睪丸組織病理形態(tài)學(xué)變化 取每組剩余8只大鼠的右側(cè)睪丸組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)處理后，行常規(guī)HE染色：脫蠟、脫二甲苯、染色、復(fù)染、脫水、固封等，然后通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)改變。

1.4.5 睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 參照1.4.4方法取左側(cè)睪丸組織后迅速切片并修成1 mm×1 mm×1 mm小塊，迅速轉(zhuǎn)移到4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液中固定1 h，然后經(jīng)常規(guī)PBS漂洗、丙酮梯度脫水，Epon812包埋、超薄切片和鉛鈾雙重染色后，通過(guò)H-7650型透射電鏡觀察并照相保存。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠空腹血糖水平、體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及血清睪酮含量比較 與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖水平顯著升高(P<0.05)，體質(zhì)量、睪丸指數(shù)和血清睪酮含量均顯著降低(P均<0.05)；與模型組比較，HLF中、高劑量組空腹血糖水平顯著降低(P均<0.05)，體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及血清睪酮含量均顯著升高(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠睪丸組織中ACP、LDH、γ-GT水平比較 與正常組比較，模型組大鼠睪丸組織中ACP、LDH、γ-GT水平均顯著降低(P均<0.05)；與模型組比較，HLF中、高劑量組大鼠睪丸組織中ACP、LDH、γ-GT水平均顯著升高(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠空腹血糖水平、體質(zhì)量、睪丸指數(shù)及血清睪酮含量比較±s)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.3 各組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)改變比較 正常組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，睪丸組織曲細(xì)精管豐富飽滿，生精細(xì)胞排列規(guī)則，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量精子，見(jiàn)圖1；模型組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)曲細(xì)精管萎縮，生精細(xì)胞脫落、數(shù)量減少，管腔內(nèi)精子數(shù)量嚴(yán)重減少等明顯的組織病變，見(jiàn)圖2；而與模型組比較，HLF各劑量組睪丸組織病變呈不同程度改善，其中以高劑量效果最為顯著，見(jiàn)圖3～5。

2.4 各組大鼠睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變比較 正常組大鼠睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，睪丸組織呈現(xiàn)細(xì)胞器豐富，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分別于細(xì)胞核周?chē)?jiàn)圖6；模型組細(xì)胞呈現(xiàn)胞體縮小、胞核固縮、細(xì)胞器減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脂滴形成等明顯的超微結(jié)構(gòu)改變，見(jiàn)圖7；而與模型組比較，HLF各劑量組大鼠睪丸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變明顯改善，其中以HLF高劑量組效果最為顯著，見(jiàn)圖8～10。

表2 各組大鼠睪丸組織中ACP、LDH、γ-GT水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

圖1 正常組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)(HE)

圖2 模型組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)(HE)

圖3 HLF低劑量組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)(HE)

圖4 HLF中劑量組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)(HE)

圖5 HLF高劑量組大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)(HE)

圖6 正常組大鼠睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖7 模型組大鼠睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖8 HLF低劑量組大鼠睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖9 HLF中劑量組大鼠睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖10 HLF高劑量組大鼠睪丸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

3 討 論

糖尿病已經(jīng)逐漸發(fā)展成為僅次于心腦血管疾病和惡性腫瘤的第三大慢性非傳染性疾病，嚴(yán)重危害著患者的生命健康。長(zhǎng)期血糖控制不佳的糖尿病患者往往并發(fā)多個(gè)組織器官損傷，是糖尿病患者致殘甚至致死的主要原因。其中，高血糖所致生殖系統(tǒng)損傷發(fā)病率在50%左右，嚴(yán)重影響著糖尿病患者的生活質(zhì)量。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變是該并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制[5-6]。

睪酮是維持雄性生殖功能最重要的雄激素，制約著睪丸生精功能，對(duì)促進(jìn)精子發(fā)生及成熟意義重大。杜靜等[7]和王偉超等[8]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病可誘導(dǎo)睪丸萎縮、睪酮水平降低，并且睪酮水平與血糖水平呈明顯負(fù)相關(guān)；睪丸質(zhì)量及睪丸指數(shù)也是反映睪丸組織狀態(tài)的重要指標(biāo)。LDH、ACP和γ-GT是臨床上監(jiān)測(cè)睪丸組織功能的3種標(biāo)志酶，其中LDH與生精上皮的成熟密切相關(guān)，ACP參與睪丸內(nèi)蛋白質(zhì)合成，γ-GT促進(jìn)精子成熟[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備2型糖尿病大鼠模型并給予山楂葉總黃酮進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)HLF干預(yù)6周能夠顯著降低2型糖尿病大鼠血糖水平，提高睪丸指數(shù)和血清睪酮水平及睪丸組織中LDH、ACP、γ-GT水平，提示HLF具有保護(hù)睪丸組織結(jié)構(gòu)、改善睪丸組織功能的作用。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠睪丸組織出現(xiàn)曲細(xì)精管萎縮變形、排列異常，各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量減少，生精細(xì)胞脫落，部分生精小管內(nèi)生精細(xì)胞消失等病理形態(tài)學(xué)變化；電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠睪丸細(xì)胞胞核縮小，核膜增厚，染色質(zhì)呈塊狀聚集，脂滴聚積、線粒體擴(kuò)張，結(jié)構(gòu)模糊不清，嵴消失[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型大鼠出現(xiàn)睪丸組織曲細(xì)精管萎縮，生精細(xì)胞脫落、數(shù)量減少，管腔內(nèi)精子嚴(yán)重減少等明顯的病理形態(tài)學(xué)變化；睪丸細(xì)胞呈現(xiàn)胞體縮小、胞核固縮、細(xì)胞器減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脂滴形成等明顯的超微結(jié)構(gòu)改變，與上述報(bào)道基本一致；經(jīng)HLF干預(yù)6周后， 2型糖尿病大鼠睪丸組織病變及睪丸細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變明顯改善。

綜上所述，HLF具有抑制2型糖尿病大鼠睪丸組織病變、改善睪丸組織功能的作用。

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The ameliorate effects of Hawthorn Leaves Flavonoids on the testicular tissue lesion in type 2 diabetic mellitus rats

KAN Minchen

(Handan Central Hospital, Handan 056008, Hebei, China)

Objective It is to investigate the ameliorate effects of Hawthorn Leaves Flavonoids (HLF) on the testicular tissue lesion in type 2 diabetic mellitus (T2DM) rats. Methods Eighty rats were randomly divided into five groups: normal group, model group and HLF low (50 mg/kg), medium (100 mg/kg), high (200 mg/kg) dose group, 16 cases in each group. All the rats were made into T2DM models by high-fat diet and injected STZ except the normal group; the drugs or normal saline were given by intragastric administration for 6 weeks, once a day. After the intervention, the level of plasma glucose was determined, the body weight and testis tissue index was calculated, the content of testosterone in serum and ACP, LDH, γ-GT in testis tissue were detected; the histopathological changes of testis tissue was observed by HE staining, the ultrastructure of testis tissue was observed by electron microscope. Results Compared with model group, the level of plasma glucose were significantly decreased, the body weight, the testis tissue index and the content of testosterone were significantly increased, the content of ACP, LDH, γ-GT in testis tissue were significantly increased in HLF high and medium dose groups, there were significant difference (allP<0.05). After HE staining under light microscope, the testicular seminiferous was atrophied, germ cell was ablated and the number was significantly reduced in model group; however, the testicular tissue lesions were improved in different degrees in all the HLF groups, and the effect of HLF high dose group was the most significant. Under the electron microscope, the cell body of testicular tissue was significantly reduced, and organelle was reduced, endoplasmic reticulum was expanded, and lipid droplet was formed, and nuclear was condensed in model group; however, the ultra-structural changes of testicular cells were significantly improved in all the HLF groups, and those of HLF high dose group was the most significant. Conclusion HLF has a protective effect on the testicular tissue of rats with T2DM.

闞敏宸，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樯窠?jīng)內(nèi)科疾病。

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(142777114D)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.18.006

R-332

A

1008-8849(2016)18-1957-04

2016-01-10