腹舒膠囊對慢傳輸型便秘大鼠腸道傳輸功能、結腸壁病理結構及SOM的影響研究

賈 濤，趙 寧

(河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056008)

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腹舒膠囊對慢傳輸型便秘大鼠腸道傳輸功能、結腸壁病理結構及SOM的影響研究

賈 濤，趙 寧

(河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056008)

目的 觀察腹舒膠囊對慢傳輸型便秘大鼠模型腸道傳輸功能、結腸壁病理結構及結腸肌間神經叢生長抑素(SOM)的影響，探討腹舒膠囊治療慢傳輸型便秘的作用機制。方法 取72只SD大鼠，隨機選取其中18只作為正常組，給予普通飼料喂養；其余大鼠給予添加大黃的飼料造模。將造模成功后大鼠隨機分為模型組、腹舒膠囊組和自然恢復組各18只。腹舒膠囊組和自然恢復組分別給予腹舒膠囊和生理鹽水灌胃2周。采用活性炭懸液推進法測定各組大鼠炭末推進長度，光鏡及電鏡觀察各組動物結腸壁的病理及超微結構變化，進行結腸肌間神經叢SOM陽性神經免疫組織化學染色半定量分析。結果 模型組炭末推進長度明顯短于正常組(P<0.05);經光鏡及電鏡觀察，模型組可見黏膜慢性炎癥改變，神經元及平滑肌細胞呈明顯退行性變化，腸壁大量嗜酸性粒細胞浸潤；免疫組化染色顯示模型組SOM免疫反應性明顯低于正常組(P<0.05)。而腹舒膠囊組灌胃2周后炭末推進長度明顯長于模型組和自然恢復組(P均<0.05)，腸壁神經病變明顯減輕，免疫組化染色顯示SOM免疫反應性明顯高于模型組和自然恢復組(P均<0.05)。結論 長期應用蒽醌類瀉劑對腸神經系統有明顯損害作用，并可引起結腸肌間神經叢神經遞質的變化。腹舒膠囊可促進結腸肌間神經叢神經遞質數量及功能恢復，對于治療慢傳輸型便秘有較好的療效。

慢傳輸型便秘；大鼠；免疫組織化學；生長抑素；腹舒膠囊

Key words: slow transmit constipation; rat; immunohistochemistry; somtostatin; Fushu capsule

慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)是以胃腸道，特別是結腸動力減弱、無便意、大便次數減少為主要特點的頑固性便秘，多伴有長期服用大劑量刺激性瀉劑史[1]。生長抑素(SOM)能神經元在肌間叢僅占5%左右，但其對腸道動力的調節作用卻不容忽視。SOM可作用于肌間叢抑制NO相關性化合物的釋放，從而減弱非腎上腺素能非膽堿能(NANC)神經抑制途徑，其可調節慢波的振幅，抑制胃泌素、人膽囊收縮素/腸促胰酶肽(CCK)、血管活性腸肽(VIP)、胰高血糖素等胃腸激素的釋放，因而可間接影響結腸運動[2]。結腸壁肌間神經叢SOM的變化在慢傳輸型便秘發病中的作用已得到證實，且電鏡發現慢傳輸型便秘患者結腸神經叢及平滑肌超微結構的病理改變支持了其存在內源性神經肌肉病變的觀點[3]。腹舒膠囊可促進腸道蠕動，并具有雙向調節功能，用于治療慢傳輸型便秘療效較好，但其作用機制尚不明確。本研究觀察了腹舒膠囊對慢傳輸型便秘大鼠模型腸道傳輸功能、結腸壁病理結構及結腸肌間神經叢生長抑素(SOM)的影響，旨在探討腹舒膠囊治療慢傳輸型便秘的作用機制。現將結果報道如下。

1 實驗資料

1.1 動物 選用清潔級健康成年SD大鼠72只，雌雄各半，體質量(185.93±3.52)g，由河北省醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號：04057。

1.2 藥物 大黃，購于石家莊樂仁堂中藥飲片廠，產地甘肅；腹舒膠囊由生白術30 g、大云15 g 、川樸12 g、木香6 g、青皮20 g、五味子15 g、陳皮10 g、黃芪12 g、杭白芍30 g、當歸10 g、生熟地各15 g、威靈仙20 g、核桃仁10 g、杏仁10 g、云苓12 g、澤瀉10 g、麥冬12 g、荔枝核20 g、枳實10 g組成，河北石家莊平安制藥廠代加工。

1.3 試劑 APES試劑，購于北京中山生物技術有限公司；SP-9002型免疫組織化學試劑盒，美國ZYMED公司產品，購于北京中山生物技術有限公司；一抗為兔抗人多克隆抗體，二抗為顯色復合物，均為北京中山生物技術有限公司產品。

1.4 方法 大鼠適應性喂養1周后，隨機選取18只作為正常組(雌雄各半)，雌雄分籠給予普通飼料飼養；其余大鼠雌雄分籠給予添加有大黃粉的飼料飼養，保持適宜的環境(室溫16～25 ℃，相對濕度50%～70%，清潔安靜)。大黃粉開始劑量為100 mg/(kg·d),以后每天給予劑量為前1 d的2倍，直至出現半數糞便變稀，然后每天保持此劑量直至80%的稀便消失，再在此基礎上加倍給藥，又有近半數糞便變稀。如此程序循環3次，待最后一次80%的稀便消失1周后停止給藥。本次實驗第9天首次出現半數大鼠糞便便稀，大黃粉用量1 600 mg/(kg·d),維持此劑量15 d，80%的大鼠稀便消失；增加大黃粉用量至3 200 mg/(kg·d),再次出現近半數糞便變稀，維持此劑量13 d，80%的大鼠稀便消失；增加大黃粉用量至6 400 mg/(kg·d),再次出現近半數糞便變稀，維持此劑量19 d，80%的大鼠稀便消失，維持此劑量1周后停止給藥，飼以普通軟飼料待處理。將造模成功后大鼠隨機分為模型組、腹舒膠囊組和自然恢復組各18只，雌雄各半。腹舒膠囊組和自然恢復組分別予腹舒膠囊和生理鹽水灌胃2周。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠體質量 造模前后及灌胃前后稱量大鼠體質量，觀察大鼠體質量變化。

1.5.2 腸道傳輸功能 采用活性炭懸液推進法測定腸道傳輸功能。模型組大鼠在完成造模后和正常組大鼠一起，腹舒膠囊組和自然恢復組灌胃結束后1周一起均禁食24 h后，經口灌入活性炭懸液1 mL/100 g(懸液濃度100 g/L)，30 min后以頸椎脫臼法處死。立即剖腹取出幽門到直腸末段的全部腸道，在無張力狀況下測量腸道全長及活性炭混懸液在腸道內推進長度，最后計算每組的平均值。

1.5.3 結腸壁病理結構和結腸肌間神經叢超微結構變化 大鼠頸椎脫臼處死，迅速剖腹取結腸中段腸管約2 cm，生理鹽水沖去腸內容物，放入4%多聚甲醛固定約24 h，行HE染色，觀察光鏡下結腸壁的變化。另切取結腸中段腸管，沖洗干凈后用鋒利刀片將結腸壁組織切成3 mm×3 mm×3 mm的小塊，浸入2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)固定48 h，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，用超薄切片機切片，厚度50 nm，應用透射電子顯微鏡觀察結腸肌間神經叢超微結構變化。

1.5.4 結腸肌間神經叢SOM免疫組織化學染色半定量分析 根據神經元胞體和纖維的分布密度及活動性強弱做相對半定量比較。所有視野未見陽性細胞為(-)；有少數弱陽性神經元為(+)，染色為淡黃色；陽性細胞較多見為()，染色為棕黃色；陽性細胞多見為()，染色為棕褐色。

2 結 果

2.1 各組大鼠實驗前后體質量及腸道外觀表現 模型組、腹舒膠囊組和自然恢復組大鼠體質量均明顯低于正常組(P均<0.05)，腹舒膠囊組和自然恢復組大鼠體質量與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表1。各組動物腸道外觀無明顯差別，結腸黏膜無色素沉著。

2.2 各組大鼠炭末推進長度比較 模型組炭末推進長度明顯短于正常組(P<0.05);腹舒膠囊組、自然恢復組炭末推進長度明顯長于模型組(P均<0.05)，但仍短于正常組 (P<0.05)；腹舒膠囊組炭末推進長度明顯長于自然恢復組(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠實驗前后體質量比較±s，g)

注：①與正常組比較，P<0.05。

表2 各組大鼠腸管總長和炭末推進 長度比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與自然恢復組比較，P<0.05。

2.3 各組結腸組織光鏡下表現 正常組未發現黏膜下層及肌間神經叢病變。模型組可見黏膜慢性炎癥；全層大量嗜酸性粒細胞浸潤，以固有膜為主，黏膜下肌部分增厚，膠原纖維化，見圖1；肌間神經叢神經細胞空泡變性、減少，見圖2。腹舒膠囊組肌間神經叢神經細胞空泡變性減輕；自然恢復組改善不明顯。

圖1 模型組結腸壁黏膜光鏡下表現(HE，×40)

圖2 模型組結腸壁肌間神經叢神經細胞及黏膜 下肌部分光鏡下表現(HE，×100)

2.4 各組結腸組織電鏡下表現

2.4.1 正常組 結腸肌間神經叢神經節內神經元較膠質細胞的數量略多，神經元與膠質細胞及其突起組成神經毯；可見到Cajal間質細胞及正常神經元,其胞質內可見豐富的粗面內質網、核糖體，滑面內質網及發達的高爾基體少見；可見正常的平滑肌細胞及無髓神經。

2.4.2 模型組 未找到Cajal間質細胞；神經元明顯退行性改變，可見胞質內大部分線粒體空泡變性，嵴排列紊亂，大部分或全部嵴消失；神經膠質細胞內可出現大小不等的空泡及脂褐素等，可見線粒體高度水腫，嵴排列紊亂，大部分消失；粗面內質網有脫顆粒現象。見圖3。

圖3 模型組結腸組織電鏡下表現(EM，×20 000)

2.4.3 腹舒膠囊組 神經髓索、平滑肌細胞、神經膠質細胞退行性變有較明顯恢復，神經髓索水腫減輕；平滑肌細胞密體增多，核旁線粒體局部水腫，嵴排列紊亂，部分嵴消失，粗面內質網有脫顆粒現象。見圖4。

圖4 腹舒膠囊組結腸組織電鏡下表現(EM，×5 000)

2.4.4 自然恢復組 神經元、平滑肌、神經膠質細胞退行性變無明顯恢復。神經元細胞大量線粒體空泡化，周圍大量膠原纖維增生，可見膠原纖維內空泡；神經膠質細胞周圍膠原纖維增生，線粒體高度水腫，嵴排列紊亂，大部分消失。

2.5 各組結腸肌間神經叢SOM免疫組織化學結果 SOM陽性細胞以胞漿著色為主，棕黃色，著色深，細胞核為藍色，見圖5。免疫組化染色半定量分析結果顯示，模型組SOM免疫反應性明顯低于正常組(P<0.05)；腹舒膠囊組免疫反應性明顯高于模型組、自然恢復組(P均<0.05)，但低于正常組(P<0.05)；自然恢復組免疫反應性與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

3 討 論

慢傳輸型便秘的病因、發病機制尚未完全清楚。相關研究發現，刺激性瀉劑如大黃、酚酞、番瀉葉等長期作用于結腸黏膜，使腸黏膜感覺信息的傳入和平滑肌收縮的信息傳出障礙，導致腸蠕動功能失調，引發慢傳輸型便秘[4]。近年來研究發現，腸神經系統中結腸肌間神經叢的病理改變可能是慢傳輸型便秘發病的一個重要原因[5]。腸神經系統主要指消化道的壁內神經叢，即黏膜叢、黏膜下叢、肌深叢、肌間神經叢和漿膜下叢。神經叢是由神經節和節間連接組成的網狀結構，神經節主要位于肌間叢和黏膜下叢。上述神經叢起始于食管下段，一直延伸到肛管齒線水平，并與膽囊和肝外膽管的壁內神經叢相互連接，形成一個局部神經系統。Hanani等[6]對168例慢傳輸型便秘患者的研究發現，隨著年齡的增加,結腸中的正常神經節及神經叢的數量逐漸減少，神經的退行性變化增加，從而引起腸傳輸功能下降。Wedel等[7]采用免疫組化技術發現在慢傳輸型便秘患者腸段中，其腸肌間神經叢和腸黏膜下神經叢中的神經節面積和正常神經元數量都較正常對照組明顯較少。因此在慢傳輸型便秘的治療中，避免結腸肌間神經叢進一步損傷及促進受損的腸神經系統結構及功能恢復具有重要的意義。

圖5 結腸肌間神經叢SOM陽性神經細胞鏡下表現(LM，×100) 表3 各組結腸肌間神經叢SOM免疫反應的 半定量分析

只

注：①與正常組比較，P<0.05 ；②與腹舒膠囊組比較，P<0.05。

目前已經確定的腸神經遞質或調質多達數十種，其中興奮性遞質主要包括 Ach 、SP、TKS、酪氨酸激酶-C等，抑制性遞質以NANC能神經遞質為主，如血管活性腸肽、生長抑素、一氧化氮。腸神經遞質的多樣性決定了其功能的復雜性。SOM能神經元存在于腸肌間神經叢內，其對腸神經系統的抑制作用機制主要在于可減少一氧化氮相關化合物的釋放，減弱NANC神經抑制途徑。杜麗娟等[8]研究發現，便塞通合劑對慢傳輸便秘大鼠的結腸傳輸功能有明顯促進作用，這種促進腸動力作用可能與此中藥方劑能抑制結腸中SOM、血管活性腸肽等的表達，以及能修復腸肌間神經叢有關。劉麗等[9]發現結腸水療聯合針刺治療能夠改善慢傳輸便秘患者的癥狀，治療后患者體內生長抑素等胃腸激素水平下降。本研究應用大黃建立慢傳輸型便秘瀉劑結腸模型，發現刺激性瀉劑可使結腸傳輸功能及結腸壁肌間神經叢SOM免疫反應性明顯降低，對腸神經系統有損壞作用。

祖國醫學認為便秘之源在脾胃，脾氣虛弱則運化不健，同時便秘與肝、肺、腎有不可分割的關系。因此充分考慮到肺、肝、腎、脾、胃的生理特點，結合現代藥理學研究成果擬定了腹舒膠囊，該方對腸道蠕動具有雙向調節作用。方中黃芪含有多種氨基酸，對多種祖細胞有促進恢復作用[10]。白術可明顯促進小腸蛋白合成，使兔離體腸管自發運動緊張性升高，收縮幅度增大；可延長淋巴細胞壽命，提高IL-2水平，并能增加T淋巴細胞表面IL-2R的表達；具有抗氧化作用，可降低過氧化脂質(LPO)含量，避免有害物質對組織細胞結構和功能的破壞作用，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，增強機體對自由基的清除能力，減少自由基對機體的損傷[11]。而生熟地、當歸、枳實均有非特異性抗炎作用[12]。因此，腹舒膠囊可通過改善細胞的營養與能量代謝，降低膠原含量，增加細胞的生命力和抵抗力，促進蛋白合成，提高人體的免疫功能；通過抗氧化酶系統，使體內SOD、過氧化氫酶活性明顯增加，使體內LPO明顯減少，從而減輕這些危險因素對細胞的損傷；并通過非特異性抗炎及抗菌消炎等作用，促進結腸腸神經叢的修復。

本實驗研究發現，給予腹舒膠囊灌胃后，半定量分析顯示大鼠結腸肌間神經叢SOM含量明顯增加，而自然恢復組改善不明顯。證實腹舒膠囊組方可促進慢傳輸型便秘模型大鼠肌間神經叢肽類遞質含量增加,其促腸道動力作用與結腸SOM的分布增加存在密切關系，可能與該組方有促進腸神經叢結構和功能恢復作用有關。

綜上所述，長期應用蒽醌類瀉劑對腸神經系統有明顯損害作用，并可引起結腸肌間神經叢神經遞質的變化。腹舒膠囊可促進結腸肌間神經叢神經遞質數量及功能恢復，對于治療慢傳輸型便秘有較好的療效，但腹舒膠囊治療慢傳輸型便秘的確切機制還需深入探討。

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Study on the effect of Fushu capsule on SOM in rat with slow transit constipation and relativity of Fushu capsule and pathologic change of colonic myenteric plexus

JIA Tao, ZHAO Ning

(Handan Central Hospital, Handan 056008, Hebei, China)

Objective It is to observe the influence of Fushu capsule on intestinal transmission function, pathological structure of colon wall and the somatostatin (SOM) in the colonic muscular plexus of the rat model of slow transit constipation (STC), and explore the mechanism of the treatment of slow transit constipation. Methods 72 healthy adult SD rats were selected. 18 rats were randomly selected as the normal group, which were fed with normal diet. The rest of the rats were given the feed of rhubarb to produce STC model, and then randomly divided into the model group, the Fushu capsule group and the natural recovery group with 18 cases in each groups. The animals in Fushu capsule group and natural recovery were given Fushu capsule and physiological saline to fill the stomach respectively for 2 weeks. The length of carbon propulsion were measured by activated carbon suspension propulsion method, the pathological and ultrastructural changes of rat colonic wall were observed by light microscope and electron microscope, and the semi quantitative analysis of immunohistochemical staining of SOM positive nerve in the muscular plexus of colon was performed. Results The length of carbon propulsion in model group was significantly shorter than that in normal group (P<0.05). The chronic inflammatory changes were discovered in the mucosa of model group, and the neurons and smooth muscle cells were obviously degenerative, a large number of Eosinophil infiltration in the intestinal wall; Immunohistochemical staining showed that the SOM of model group was significantly lower than that of normal group (P<0.05). 2 weeks after filling the stomach, the carbon propulsion length in Fushu caspsule group was significantly longer than that in the model group and natural recovery group (allP<0.05); the intestinal wall neuropathy was significantly reduced; Immunohistochemical staining showed that SOM immunoreactivity was significantly higher than that of model group and natural recovery group (allP<0.05). Conclusion Long application of danthron purgative is harmful to enteric nervous system. Fushu capsule can promote recovery with the neuropeptide amount and function and pathologic change of colonic muscular plexus.

賈濤，男，博士，副主任醫師，主要從事食管癌、肺癌等外科疾病的臨床工作。

趙寧，Tel：13363080806

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.18.004

R-332

A

1008-8849(2016)18-1949-05

2015-11-19