嗜神經病毒衍生肽RVG29介導的靶向納米載藥膠束的合成及抗腫瘤活性

韓海玲, 金順子, 苗 壯, 陳 平, 王占峰, 謝志剛

(1. 吉林大學公共衛生學院, 衛生部放射生物學重點實驗室, 長春 130021;2. 北華大學附屬醫院心內三科, 吉林 132011;3. 吉林大學中日聯誼醫院神經外二科, 長春 130033;4. 中國科學院長春應用化學研究所, 高分子物理與化學國家重點實驗室, 長春 130022)

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嗜神經病毒衍生肽RVG29介導的靶向納米載藥膠束的合成及抗腫瘤活性

韓海玲1,2, 金順子1, 苗 壯3, 陳 平3, 王占峰3, 謝志剛4

(1. 吉林大學公共衛生學院, 衛生部放射生物學重點實驗室, 長春 130021;2. 北華大學附屬醫院心內三科, 吉林 132011;3. 吉林大學中日聯誼醫院神經外二科, 長春 130033;4. 中國科學院長春應用化學研究所, 高分子物理與化學國家重點實驗室, 長春 130022)

將羧基化的水溶性葡聚糖(Dex)與紫杉醇(PTX)化學偶聯, 制得載藥納米膠束M(PTX), 再將M(PTX)與嗜神經性病毒衍生肽(RVG29)化學偶聯, 得到RVG29靶向的載藥納米膠束M(RVG,PTX). 采用核磁共振氫譜(1H NMR)測定了Dex-PTX及RVG-Dex-PTX鍵合物的分子量, 并對2種膠束進行了表征, 考察了2種膠束對腫瘤細胞的抑制效果及細胞凋亡情況, 觀察了C6細胞對熒光標記M(RVG,PTX)和M(PTX)的攝取情況. 結果表明, 羧基化葡聚糖-紫杉醇鍵合物的分子量約為16500, 紫杉醇的質量約為葡聚糖的20%, RVG29的質量約為葡聚糖的10%. 2種膠束的粒徑在45～60 nm之間; M(RVG,PTX)膠束對C6細胞的抑制作用具有濃度和時間依賴性, 細胞抑制率隨著作用時間和藥物濃度增加而增加, 且M(RVG,PTX)膠束對C6細胞的抑制作用強于M(PTX)膠束. 細胞攝取實驗結果表明, 與M(PTX)相比, C6細胞攝取了更多的M(RVG,PTX)膠束. 如果先用游離的RVG29處理C6細胞, 再進行細胞實驗, 則M(RVG,PTX)膠束對C6細胞生長的抑制作用及被C6細胞攝取的比率顯著降低, 與 M(PTX)相當. 表明靶向載藥膠束M(RVG,PTX)中的RVG29保留了游離RVG29的活性, 對C6細胞依然具有靶向效應, 從而介導了M(RVG,PTX)被C6細胞的攝取, 增強了對C6細胞的生長抑制作用. 由于M(RVG,PTX)膠束只使用水溶性葡聚糖作載體, 不涉及疏水高分子鏈段, 不需要分別制備載藥高分子和靶向高分子然后再共組裝, 因而制備過程比較簡單, 同時具有載藥和靶向功能.

嗜神經性病毒衍生肽; 腦膠質瘤; 腫瘤靶向; 紫杉醇; 納米載藥膠束

腦膠質瘤是顱內常見惡性腫瘤, 發病率約占顱內腫瘤的40%. 高復發率和高惡性度導致患者5年存活率極低. 目前治療方法有手術、 放射和化學治療, 對Ⅲ-Ⅳ級膠質瘤主要采用化學治療[1～3]. 但由于血腦屏障和腫瘤的耐藥性, 現有腦膠質瘤化療藥物品種有限, 療效欠佳, 對延長患者存活期幾乎無貢獻[4]. 隨著納米技術的發展, 納米藥物在癌癥治療中顯示出巨大的潛力和優越性. 其中, 腫瘤靶向給藥體系將藥物選擇性地送到病變部位或病變細胞, 可以提高藥物的生物利用度, 降低毒副作用, 因而備受關注[5]. 紫杉醇(PTX)是多種腫瘤的一線化療藥物, 但其水溶性差, 臨床劑型難以通過血腦屏障, 對腦膠質瘤幾乎無效[6]. Jing等[7～11]設計了多種納米給藥系統, 將PTX鍵合在兩親性嵌段共聚物分子鏈上再自組裝成納米膠束. 與傳統的物理包裹不同, 這種鍵合型納米膠束可有效地增溶難溶性藥物, 避免初期暴釋, 延長藥物在體內的循環時間, 提高生物利用度. 通過載藥高分子和靶向高分子的共組裝, 可以制得具有靶向功能的載藥納米膠束, 將藥物選擇性地送到病變部位或病變細胞, 進一步提高藥物的生物利用度, 降低毒副作用. 但此類制劑使用兩親性嵌段共聚物作為基本載體, 合成難度較高, 新藥審批的難度也比較大[12,13].

狂犬病病毒是自然界存在的嗜神經病毒, 其衣殼中包含有嗜神經性蛋白質(RVG), 能被神經細胞表面的尼古丁乙酰膽堿受體(nAchR)特異性地識別. 在RVG作用下, 狂犬病病毒很容易越過血腦屏障, 侵襲腦組織和神經中樞, 引發狂犬病. 研究發現, RVG中的29個氨基酸序列嗜神經性病毒衍生肽(RVG29)[13～15](YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)同樣可被nAchR特異性地識別. Liu等[16]和Gong等[17]將RVG29鍵合到聚酰胺-胺樹狀聚合物(PAMAM)和聚亞乙胺(PEI)上, 用以擔載和輸送核酸類藥物, 具有一定的腦靶向效果. 經RVG29修飾的PAMAM和PEI能夠通過血腦屏障(BBB)模型, 但對細胞毒類抗癌藥物的腦靶向輸送鮮有報道.

葡聚糖可以在肝、 脾、 腎和消化道被葡聚糖酶降解, 毒性極低, 用葡聚糖修飾的高分子膠束在體內具有類似聚乙二醇(PEG)的“隱形”效果. 載藥葡聚糖納米顆粒可減少肝臟對藥物的清除, 提高在高度血管化的癌變組織中的藥物濃度[18,19]. 本文首先將葡聚糖羧基化, 然后將羧基化的葡聚糖與紫杉醇(PTX)化學偶聯, 制得載藥納米膠束M(PTX), 將M(PTX)與RVG29化學偶聯, 得到RVG29靶向的載藥納米膠束M(RVG,PTX), 考察腦膠質瘤C6細胞對M(PTX)和M(RVG,PTX)的攝取能力和2種膠束對C6細胞生長的抑制能力, 通過比較M(PTX)和M(RVG,PTX)被細胞攝取和抑制細胞生長的能力研究RVG29的引入對細胞攝取及細胞凋亡的貢獻, 判斷M(RVG,PTX)膠束越過BBB, 實現腦靶向的可能性.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

N,N′-二環己基碳二亞胺(DCC)、 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和狂犬病病毒衍生肽(RVG29), 上海吉諾生物技術有限公司; 葡聚糖(Dex, 分子量10000), 上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 紫杉醇(PTX), 西安寶賽生物科技有限公司; 二氯甲烷(DCM)和三乙胺(TEA), 分析純, 北京化工廠, 使用前用氫化鈣干燥后蒸餾; 乙腈, 色譜純, 上海復旦化學試劑有限公司; 二次蒸餾水, 用SZ-93型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)制備; 磷酸鹽緩沖溶液(PBS), 濃度為0.01 mol/L (pH =7.4); 醋酸纖維素材質的透析袋, 截留分子量3500; 鼠C6膠質瘤細胞系(C6細胞), 吉林大學基礎醫學院生化教研室; 培養基: DMEM(美國Sigma公司)+10%(體積比)熱滅活小牛血清+青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL, pH=7.2～7.3, 過濾消毒; 小牛血清, 杭州四季青生物材料有限公司; 青霉素和鏈霉素, 華北制藥廠; 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT), 上海阿拉丁試劑公司.

德國Varian公司Unity-400型或300型核磁共振儀(1H NMR), 溶劑為DMSO-d6, 以四甲基硅烷(TMS)為內標; 美國Perkin Elmer公司LS-55型熒光光譜儀; 德國Leica公司TCS SP2型共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM); 英國Malvern 公司Nano ZS90型激光粒度儀; 日本JEOL公司JEM-1011型透射電子顯微鏡(TEM); 美國Wyatt Technology公司DAWN EOS型動態光散射儀(DLS); 美國BD Bioscience公司FACS Calibur型流式細胞儀(FCM).

1.2 M(PTX)和M(RVG,PTX)的制備及表征

M(PTX), RVG-Dex-PTX及M(RVG,PTX)的制備過程如Scheme 1所示.

Scheme 1 Synthesis routs of M(PTX), RVG-Dex-PTX and M(RVG,PTX)

參照文獻[20]方法, 將葡聚糖與丁二酸酐反應, 制備羧基化葡聚糖; 將65 mg羧基化葡聚糖和20 mg紫杉醇溶解在10 mL DMF中, 再加入8 mg DCC和5 mg DMAP, 室溫下反應24 h, 過濾后用乙醇沉淀, 得到62 mg 葡聚糖-紫杉醇鍵合物(Dex-PTX); 將20 mg Dex-PTX溶于5 mL DMF中, 然后加入10 mL二次蒸餾水, 攪拌2 h后透析24 h以除去有機溶劑, 得到Dex-PTX的納米膠束M(PTX).

在50 mg M(PTX)納米膠束溶液(10 mL)中加入23 mg EDC和26 mg sulfo-NHS, 室溫攪拌4 h后, 加入5 mg RVG29, 繼續攪拌24 h, 透析除去未反應的RVG29, 獲得RVG29靶向膠束M(RVG,PTX), 凍干備用. 構成該膠束的聚合物即為RVG-Dex-PTX.

1.3 羧基化葡聚糖的生物相容性檢測

將消化對數生長期的C6細胞制成2×105Cell/mL的懸液, 接種于96孔培養板, 每孔100 μL細胞懸液(2×104Cell), 并加入200 μL羧基化葡聚糖的DMEM溶液, 濃度分別為20, 40, 80, 160, 320 μg/mL, 培養1～5 d, 以DMEM培養液作為對照, 采用臺盼藍染色法檢測各組的細胞數, 考察載體材料的生物相容性.

1.4 載藥膠束對腦膠質瘤C6細胞的抑制作用

1.4.1 MTT實驗 將消化對數生長期的C6細胞制成2×105Cell/mL的細胞懸浮液, 接種于96孔培養板上, 每孔100 μL懸浮液(2×104Cell), 貼壁生長24 h后, 加入200 μL M(RVG,PTX)膠束或M(PTX)膠束溶液(其紫杉醇含量分別為40, 20, 10, 5.0 μg/mL), 分別培養24, 48和72 h, 以DMEM培養液為對照, 采用MTT法檢測. 細胞抑制率(CI)由公式CI(%)=(AControl-AExp.)/AControl×100%[AControl和AExp.分別為對照組和實驗組MTT反應產物甲瓚(Formazan)溶液在570 nm的吸光度]計算.

1.4.2 FCM檢測細胞凋亡率 將消化C6細胞接種于25 cm2培養瓶中, 細胞密度5×105Cell/mL, 于37 ℃培養24 h后更換培養液, 分別加入PTX濃度為0, 20和40 μg/mL的M(PTX)或M(RVG,PTX)膠束溶液, 計時. 在24和48 h分別收集各組細胞, 加入0.5 mL冰冷的70%乙醇溶液中, 于-20 ℃冰箱保存. 將單細胞懸液以1000 r/min離心10 min, 棄去固定液, 用冷PBS緩沖液漂洗2次(1000 r/min, 5 min), 調整細胞為1×109Cell/L, 加入5 μL Annexin V, 195 μL PBS緩沖液及20 μL PI, 室溫避光孵育20 min, 用FCM檢測細胞凋亡率. 每個劑量組檢測3個平行樣, 取平均值.

1.5 C6細胞對M(PTX)和M(RVG,PTX)的攝取

1.5.1 CLSM檢測 通過DCC縮合方法制備Cy5標記的葡聚糖(Cy5-Dex). 取50 mg分子量為10000的葡聚糖和21 mg Cy5溶解于20 mL DMF, 加入 25 mg DCC和8 mg DMAP, 室溫攪拌24 h后過濾, 用50 mL乙醇沉淀得到Cy5-Dex. 將Cy5-Dex和Dex-PTX及RVG-Dex-PTX共組裝, 制備熒光標記的納米膠束M(Cy5,PTX)和M(Cy5,RVG,PTX). 考慮到2種膠束熒光量子效率可能有差別, 首先用熒光光度計測定不同濃度Cy5-Dex的2種膠束溶液的熒光強度, 根據熒光強度的具體數值, 適度稀釋較強熒光溶液, 確保2種溶液熒光強度在讀數誤差范圍內, 然后用于細胞的攝取.

用1% PBS緩沖液沖洗預先培養在NEST玻底培養皿(上海耐思科學有限公司)上的C6細胞3次, 加入等體積相同熒光強度的M(Cy5,PTX)和M(Cy5, RVG,PTX)膠束溶液, 于37 ℃避光孵育1～2 h, 用PBS緩沖液洗滌細胞, 加入3.7%多聚甲醛固定細胞12 min, 用PBS緩沖液沖洗, 滴加50 μL PBS/甘油混合溶液(體積比1∶1), 蓋上專用蓋玻片, 進行CLSM觀察.

1.5.2 FCM檢測 將1 mL 密度為1×106Cell/mL的細胞懸液種植在6孔板中, 以DMEM為培養基, 于37 ℃無菌培養, 觀察到細胞均勻貼壁生長后, 加入等體積等熒光強度的M(Cy5,PTX)和M(Cy5, RVG, PTX)膠束溶液, 反應1～2 h后倒掉培養基, 加入1 mL胰蛋白酶, 孵育1 min左右, 在顯微鏡下觀察細胞由貼壁狀態變為懸浮狀態. 收集細胞懸液, 以1000 r/min的速度離心5 min, 棄去上清液, 離心管底部細胞重新用新鮮的0 ℃ PBS緩沖液吹打懸浮. 重復3次后, 取3 mL 細胞懸液, 用200目尼龍布過濾后, 用流式細胞儀(BD Biosciences)進行測試, 記錄10000個細胞的熒光信號, 計算平均值.

1.6 RVG封閉

在以上細胞攝取和生長抑制實驗中, 為了證明RVG納米膠束是通過RVG受體介導的途徑進入細胞, 專門設立一個細胞實驗組, 在孵育介質中加入游離RVG29, 使其濃度為40 μg/mL, 孵育30 min后再加入M(RVG,PTX)或M(Cy5, RVG,PTX)膠束溶液, 其它條件與正常M(RVG,PTX)或M(Cy5,RVG,PTX)組相同. 這一過程稱為“RVG封閉(RVG-shielding)”, 相應樣品稱為“RVG-shielded M(RVG,PTX)”或“RVG-shielded M(Cy5,RVG,PTX)”.

1.7 統計分析

細胞實驗數據表述為“平均值(X)±標準偏差(SD)”. 采用t-檢驗方法分析各實驗組與對照組之間的統計偏差,p< 0.05 視為實驗偏差有統計學意義.

2 結果與討論

2.1 聚合物和納米膠束的表征

Fig.1 TEM image of M(RVG,PTX) Inset: size distribution determined by DLS.

羧基化的葡聚糖是葡聚糖與丁二酸酐的反應產物, 通過1H NMR計算得到葡聚糖的羧基化率約為50%, 即平均每個葡聚糖鏈上有31個羧基. 按1H NMR峰面積計算出Dex-PTX分子量為16500, 紫杉醇的質量分數為葡聚糖的20%, 即每個葡聚糖分子鏈上約鍵合4個PTX; RVG-Dex-PTX分子量為19800, 即每個分子鏈上平均鍵合1個RVG29分子(分子量約3370). 圖1為M(RVG,PTX)的TEM照片. 可以看出, 膠束基本呈球形. 用DLS方法(圖1插圖)測得的膠束直徑, M(PTX)為(50.9±3.0) nm, M(RVG,PTX)為(60.8±4.0) nm. 由于紫杉醇是鍵合在Dex側鏈上, 并且高度疏水, 因而紫杉醇的疏水聚集是形成納米顆粒的驅動力. 紫杉醇及與其鍵合的葡聚糖鏈段處于顆粒的內部, 未鍵合紫杉醇的葡聚糖分子鏈連同游離的丁二酸羧基構成顆粒的外層, 因而整個聚集體呈雙層膠束形態, 使紫杉醇得到有效保護, 在膠束中的含量高達20%, M(PTX)膠束在水中的溶解性很好. M(PTX)膠束的臨界膠束濃度(cmc)為0.4 mg/L, 說明M(PTX)膠束在水和體液中有較好的穩定性. M(RVG,PTX)膠束的cmc值為0.43 mg/L. 由于RVG29是在Dex-PTX膠束形成后連接上去的, 處于M(RVG,PTX)膠束的外層, 既增加M(RVG,PTX)膠束的溶解性, 又保證RVG29靶向多肽與C6細胞表面受體的充分接觸和作用, 實現膠束的靶向功能. 利用葡聚糖的水溶性和紫杉醇的疏水性, 既實現了紫杉醇的高效擔載, 又實現了靶向多肽RVG29的有效鍵合, 從而省去了常規雙親高分子所要求的疏水鏈段, 也避免了分別制備載藥高分子和靶向高分子, 再進行共組裝的過程.

采用臺盼藍染色法進行C6細胞在加有羧基化葡聚糖的DMEM培養液中培養24～120 h后的細胞計數, 結果如表1所示. 在所考察的載體濃度和培養時間范圍內, 載體材料對C6細胞生長沒有抑制作用, 表明載體材料具有很好的生物相容性. 載體制備過程也沒有引入細胞毒性.

Table 1 Cell counting of C6 glioma treated with carboxylated dextran

2.2 載藥膠束對C6細胞增殖的抑制作用

圖2給出了M(PTX)和M(RVG,PTX)膠束溶液對膠質瘤C6細胞生長的抑制效果. 隨膠束用量的增加和作用時間的延長, 對C6細胞生長的抑制率明顯增加. 經統計學處理, 各實驗組與對照組之間有顯著性差異(p<0.05). 由于葡聚糖和RVG29對C6細胞的生長沒有抑制作用, 所以M(PTX)和M(RVG,PTX)對C6細胞的抑制作用來自膠束中所鍵合的紫杉醇. 在細胞培養條件下, 載藥納米顆粒進入細胞, 在細胞內的酸性環境下, 連接紫杉醇的酯鍵發生水解, 紫杉醇分子從高分子鏈上解離下來, 變成游離的紫杉醇而發揮抑制作用.

Fig.2 Cell inhibition of C6 glioma by M(PTX), M(RVG,PTX) and RVG-shielded M(RVG,PTX),determined by MTT assay as a function of PTX concentration Incubation time/h: (A) 24, (B) 48, (C) 72.

靶向載藥膠束M(RVG,PTX)的腫瘤細胞抑制率明顯高于非靶向載藥膠束M(PTX), 在每個PTX濃度值和每個時間點都可觀察到這種差別. 當PTX濃度為5 μg/mL時, 在24, 48和72 h時, M(PTX)組的C6細胞抑制率分別為(32±1.8)%, (44±1.8)%和(50±1.8)%, 而M(RVG,PTX)組的C6細胞抑制率分別為(43±2.8)%, (58±3.1)%和(62±3.1)%, 差別顯著(p<0.05).

為進一步證實腫瘤細胞抑制率的增加是通過RVG29的靶向作用實現的, 采用游離RVG29多肽預先封閉相關受體, 再給予靶向載藥膠束M(RVG,PTX), 結果如圖2中“RVG-shielded”組所示. 可見封閉后M(RVG,PTX)的細胞抑制率與M(PTX)膠束組的抑制率無明顯差別. 當PTX濃度為5 μg/mL時, 24, 48和72 h時M(RVG,PTX)組的C6細胞抑制率分別為(43±2.8)%, (58±3.1)%和(62±3.1)%, 而RVG-shielded組的C6細胞抑制率分別為(34±2.6)%, (43±2.2)%, (52±2.2)%, 均明顯低于靶向載藥膠束組, 與未經封閉的M(PTX)組相當[(32±1.8)%, (44±1.8)%和(50±1.8)%]. 說明游離RVG29與C6細胞上受體的結合能力強于鍵合后的RVG29, 而且在不封閉條件下M(RVG,PTX)的抑制效果是與RVG29的存在分不開的, RVG29與細胞表面受體作用所介導的細胞內吞增強了細胞對納米膠束的攝取, 提高了細胞內的藥物濃度, 增強了抑制效果.

2.3 細胞凋亡率

表2給出了用流式細胞儀檢測的C6膠質瘤細胞的凋亡率數據. 細胞凋亡是指細胞程序化死亡, 腫瘤發生發展過程中伴隨著細胞凋亡異常(凋亡減弱). 因此, 通過不同途徑誘導及增強腫瘤細胞凋亡是抑制腫瘤生長的有效途徑. 膜磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜的內側翻轉到外側是早期細胞凋亡的一個重要標志, 而PS與AnnexinV染料有很高的親和力. PI染料分子不能通過完好的細胞膜卻能夠通過破裂的細胞膜. 因而進行Annexin V和PI雙染可區分正常細胞、 早期凋亡細胞、 晚期凋亡細胞及壞死細胞[21,22]. 本文用流式細胞儀檢測不同膠束處理的C6細胞, 測定Annexin V和PI雙陽性的細胞比率, 即晚期細胞凋亡率. 與對照組[(1.15±0.2)%]相比, 用藥組的凋亡比率有明顯提高, 從M(PTX)組的(43.7±0.7)%到M(RVG,PTX)組的(58.9±0.7)%(PTX濃度20 μg/mL, 48 h), 具有顯著性差異(p<0.01). 同時這種誘導凋亡作用隨著藥物作用時間(從24 h到48 h)的增加而增加, 差異也有顯著性(p<0.05). RVG29靶向膠束M(RVG,PTX)的凋亡率高于單純載藥膠束M(PTX), 甚至20 μg/mL M(RVG,PTX)組的細胞凋亡率高于40 μg/mL的M(PTX). 經過RVG29封閉后的M(RVG,PTX)組細胞凋亡檢測結果與單純膠束M(PTX)組相似, 無明顯差異, 證實M(RVG,PTX)膠束對C6細胞的凋亡誘導作用是通過RVG靶向作用實現的.

Table 2 Effect of micelle treatment on apoptosis rate

2.4 CLSM及FCM檢測細胞攝取

圖3是M(Cy5,PTX), M(Cy5,RVG,PTX)和RVG29封閉后再用M(Cy5,RVG,PTX)處理的C6細胞的CLSM顯微照片. 藍色部分是用Hoechst33342染色的細胞核, 紅色熒光來自染料標記的納米顆粒. 由圖3(A)和(B)可見, 紅色熒光來自細胞漿部位, 說明M(Cy5,RVG,PTX)和M(Cy5,PTX)膠束已經被C6細胞吸收且多聚集于細胞漿中. 為了證實細胞對靶向膠束的攝入作用是通過RVG29介導的, 對一組細胞先進行RVG29封閉, 30 min后給予靶向膠束M(Cy5,RVG,PTX), 結果表明, 細胞內平均熒光強度低于正常靶向膠束組, 而與單純載藥膠束組相似.

Fig.3 CLSM images of C6 cells after incubation for 2 h in the presence of M(Cy5, RVG,PTX)(A),M(Cy5,PTX)(B) and RVG-shielded M(Cy5,RVG,PTX)(C) micelles

由FCM檢測細胞的Cy5熒光強度的結果可見, 靶向膠束組的熒光強度明顯高于非靶向膠束組[(70.0±4.7)對(46.7±2.6), 1 h, 見表3], 差異具有統計學意義(p<0.05), 并且在使用RVG29預先封閉后, 靶向膠束組的效果明顯降低, 差異具有統計學意義.

用CLSM和FCM方法檢測細胞攝取的結果能夠互相印證, 說明經RVG29修飾的膠束由于RVG受體介導的細胞內吞作用, 比較容易被C6細胞內吞, 這也是靶向載藥膠束M(RVG,PTX)比非靶向載藥膠束M(PTX)有更強的C6細胞抑制能力的原因.

Table 3 Flow cytometry detection of cellular uptake by C6 cells

3 結 論

將羧基化后的葡聚糖與紫杉醇化學偶聯, 制備了載藥納米膠束M(PTX), 進而將M(PTX)與RVG29化學偶聯, 制備了RVG29靶向的載藥納米膠束M(RVG,PTX), 實現了在同一個載體高分子鏈上既鍵合藥物分子, 又鍵合靶向分子. 與通常的基于雙親高分子的靶向載藥膠束相比, 本文方法充分利用了葡聚糖的生物相容性、 水溶性和可反應性以及紫杉醇的疏水性, 避免了分別合成載藥高分子和靶向高分子然后進行共組裝的麻煩, 不需要使用專門的疏水聚合物鏈段, 就能使紫杉醇的含量達到20%, 且膠束的水溶性和凍干后的復溶性都很好, 因而具有實際應用的潛力. 體外MTT, CLSM和FCM實驗結果表明, 靶向載藥膠束M(RVG,PTX)對C6細胞增殖的抑制能力強于載藥膠束M(PTX). 這種抑制作用主要表現為腫瘤細胞的凋亡, 這種增強的細胞生長抑制和細胞凋亡與M(RVG,PTX)膠束表面的RVG29相關. RVG29經過與葡聚糖鍵合和膠束化后依然保持對C6細胞的靶向性, 即與C6細胞表面RVG受體的特異性識別和結合能力. M(RVG,PTX)正是通過RVG29的靶向作用提高了藥物的攝入效率, 增強了對腦膠質瘤C6細胞的抑制作用, 具有良好的應用前景.

[1] Ostrom Q. T., Gittleman H., Liao P., Rouse C., Chen Y., Dowling J., Wolinsky Y., Kruchko C., Barnholtz S. J.,Neuro-oncol., 2014, 16(4), 1—63

[2] Talibi S. S., Talibi S. S., Aweid B., Aweid O.,Ann.Med.Surg., 2014, 3(3), 55—59

[3] Bechet D., Mordon S. R., Guillemin F., Guillemin F. F., Barberi-Heyob M. A.,CancerTreat.Rev., 2014, 40(2), 229—241

[4] Kirkpatrick J. P., Sampson J. H.,Semin.Radiat.Oncol., 2014, 24(2), 289—298

[5] Felice., Prabhakaran M. P., Rodrguez A. P., Ramakrishna S.,Mat.Sci.Eng.C-Mater., 2014, 41, 178—195

[6] Wang H., Zhang C., Zhang L. H., Liu L. X., Zheng Y., Zhu D. W.,Chem.J.ChineseUniversities, 2014, 35(10), 2239—2245(王海, 張超, 張琳華, 劉蘭霞, 鄭義, 朱敦皖. 高等學校化學學報, 2014, 35(10), 2239—2245)

[7] Xie Z. G., Guan H. L., Chen X. S., Lu C. H., Chen L., Hu X. L., Shi Q., Jing X. B.,J.Control.Release, 2007, 117(2), 210—216

[8] Liu S., Jing X. B.,J.Control.Release, 2011, 152(1), 123—124

[9] Wu D., Zheng Y. H., Hu X. L., Fan Z. M., Jing X. B.,Mat.Sci.Eng.C,Mater., 2015, 53, 68—75

[10] Xu X. L., Chen X. S., Wang Z. F., Jing X. B.,Euro.J.Pharm.Biopharm., 2009, 72(1), 18—25

[11] Zhang X. F., Li Y. X., Chen X. S., Wang X. H., Xu X. Y., Liang Q. Z., Hu J. L., Jing X. B.,Biomaterials, 2005, 26(14), 2121—2128.

[12] Yu H. Y., Tang C. H., Song W. T., Deng M. X., Chen X. S.,Chem.J.ChineseUniversities, 2014, 35(5), 903—916 (于海洋, 湯朝暉, 宋萬通, 鄧明虓, 陳學思. 高等學校化學學報, 2014, 35(5), 903—916)

[13] Xie Z. G., Lu T. C., Chen X. S., Lu C. H., Zheng Y. H., Jing X. B.J.Appl.Polym.Sci., 2007, 105(4), 2271—2279

[14] Lafon M.,J.Neurovirol., 2005, 11(1), 82—87

[15] Sejin S., Do W. H, Kaushik S. H., Hoon J. J., Tae G. P., Soo L. D., Won J. K.,J.Control.Release, 2011, 155(1), 18—25

[16] Liu Y., Huang R. Q., Han L., Ke W. L., Shao K., Ye L. Y., Lou J. N., Jiang C.,Biomaterials, 2009, 30(25), 4195—4202

[17] Gong C., Li X. N., Xu L. L., Zhang Y. H.,Biomaterials, 2012, 33(12), 3456—3463

[18] Hao H. Q., Yao P.,Chem.J.ChineseUniversities, 2014, 35(3), 652—659 (郝和群, 姚萍. 高等學校化學學報, 2014, 35(3), 652—659)

[19] Raveendran R., Bhuvaneshwar G. S., Sharma C. P.,Carbohyd.Polym., 2016, 137, 497—507

[20] Arranz F., Sanchez Chaves M., Ramirez J. C.,Angew.Makromol.Chem., 1992, 194, 79—88

[21] Ji Y. B., Qu Z. Y., Zou X.,Exp.Toxicol.Pathol., 2011, 63(1/2), 69—78

[22] Ding G. B., Li B. C., Guo Y., Xu L.,Chem.J.ChineseUniversities, 2014, 35(11), 2324—2328(丁國斌, 李彬春, 郭軼, 徐力. 高等學校化學學報, 2014, 35(11), 2324—2328)

(Ed.: W, Z)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.20904002), the Program for New Century Excellent Talents in University of Ministry of Education of China(No.NCET-10-0171), the Young Scholars Programs of Science and Technology Commission Foundation of Jilin Province, China(No. 20130522020JH), the Programs of Educational Commission of Jilin Province of China During the 12th Five-Year Plan Period(No.2013107027) and the High-Technology Research and Development Programs of Jilin Province of China(No.JF2012C005-2).

Synthesis and Antitumor Activity of Targeting and Nano Drug-Carrying Micelles Mediated by Rabies-virus-derived Peptide RVG29?

HAN Hailing1,2, JIN Shunzi1, MIAO Zhuang3, CHEN Ping3,WANG Zhanfeng3*, XIE Zhigang4

(1.MinistryofHealthKeyLaboratoryofRadiobiology,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun130021,China;2.DepartmentofCardiac,AffiliatedHospitalofBeihuaUniversity,Jilin132011,China;3.DepartmentofNeurosurgery,ChinaJapanUnionHospital,JilinUniversity,Changchun130033,China;4.StateKeyLabofPolymerPhysicsandChemistry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,Changchun130022,China)

Starting with water soluble dextran(Dex), paclitaxel(PTX)-carrying micelles M(PTX) and Rabies-virus-derived peptide(RVG29)-targeted and PTX-carrying micelles M(RVG,PTX) were prepared, by carboxylation of dextran and subsequently by conjugating PTX and RVG29 onto the carboxylated dextran. The products were characterized with nuclear magnetic resonance(1H NMR) spectroscopy, transmission electron microscopy(TEM), and dynamic light scattering(DLS). The uptakes of the micelles by C6cells and the inhibition rates of C6cell growth by the micelles were measured by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) assay, by confocal laser scanning microscopy(CLSM), and by flow cytometry(FCM). The results showed that molecular weight of Dex-PTX was about 16500 and that of RVG-Dex-PTX was about 19800. Micelles M(PTX) and M(RVG, PTX) assumed a shape of spheres with a diameter of 45—60 nm. The mass ratio of Dex, PTX and RVG29 was about 100∶20∶10. M(RVG, PTX) exhibited higher cell growth inhibition rate against C6cells than M(PTX) and C6cells took in more M(RVG,PTX) than M(PTX) under the same experimental conditions. When C6cells were treated with free RVG29 prior to cellular experiments, the inhibition rate against C6cells and the uptake by C6cells of M(RVG,PTX) were significantly decreased and came to a level of M(PTX). This implied that the enhanced inhibition of C6cell growth by M(RVG,PTX) and the enhanced uptake of M(RVG,PTX) by C6cells were mediated by RVG29, and the RVG29 species after conjugation with Dex reserved the targeting ability of RVG29 itself to a reasonable extent. Furthermore, in the preparation of M(RVG, PTX) micelles, only Dex was used as a carrier polymer, no hydrophobic polymer segments were involvd and there was no need of preparing drug-carrying copolymers and targeting copolymers, separately, and then doing co-assembling of them. In short, the manufacturing of M(RVG,PTX) micelles is relatively simple but they have the functions of drug-carrying and C6-cell targeting, therefore, their practical application is expected.

Rabies-virus-derived peptide; Glioma; Tumor targeting; Paclitaxel; Nano drug-carrying micelle

10.7503/cjcu20150941

2015-12-09.

日期: 2016-03-04.

國家自然科學基金(批準號: 20904002)、 教育部新世紀優秀人才計劃項目(批準號: NCET-10-0171)、 吉林省科技廳青年項目(批準號: 20130522020JH)、 吉林大學白求恩醫學科研支持計劃(批準號2013107027)、 吉林省教育廳十二五重大課題(批準號: 2013107027)和吉林省高技術產業發展專項項目(批準號: JF2012C005-2)資助.

O629; R730

A

聯系人簡介: 王占峰, 男, 博士, 副主任醫師, 主要從事腦腫瘤和腦血管病的納米藥物治療和基礎研究.

E-mail: 1206hhl@sina.com