表面解吸常壓化學電離質譜法快速判別樟樹化學型

劉星星, 方小偉, 黃學勇, 張婷婷, 陳煥文, 羅麗萍

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室, 南昌 330047;2. 東華理工大學江西省質譜科學與儀器重點實驗室, 南昌 330013)

?

表面解吸常壓化學電離質譜法快速判別樟樹化學型

劉星星1, 方小偉2, 黃學勇1, 張婷婷1, 陳煥文2, 羅麗萍1

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室, 南昌 330047;2. 東華理工大學江西省質譜科學與儀器重點實驗室, 南昌 330013)

采用表面解吸常壓化學電離質譜(SDAPCI-MS)技術直接對5種化學型的樟樹葉粉末片劑進行分析, 獲得其化學指紋譜圖信息. 采用主成分分析(PCA)、 聚類分析(CA)和反向傳輸人工神經網絡(BP-ANN)對譜圖信息進行分析, 獲得各化學型樟樹葉粉末片劑的特征質譜信息, 進而對不同化學型樣品進行判別. 結果表明, 在正離子模式下, SDAPCI-MS能快速獲取樟樹的化學指紋譜圖; PCA分析中的PC1, PC2和PC3貢獻率分別為79.9%, 12.9%和4.2%, 共計97.0%. SDAPCI-MS結合CA和BP-ANN測試樣本準確率均為100%, 能夠快速、 有效地判別出樟樹化學型.

樟樹; 化學型; 表面解吸常壓化學電離質譜; 多變量分析

植物化學型(Chemotype)是指同種植物在形態上差異不明顯, 但所含化學成分存在差異, 可將其分為多種類型, 是植物種內生物多樣性的一種表現[1]. 研究[2]發現, 植物化學型的主要類型包括揮發油類、 黃酮類、 香豆素類和生物堿類等4大類. 樟樹[Cinnamomumcamphora(L.) Presl]是樟科樟屬植物中經濟價值較高的樹種之一, 是集藥用、 材用、 香料和風景園林等用途于一體的多途優良樹種, 富含多種揮發油[3]. 按樟樹葉中揮發油主要成分的不同, 可分為芳樟(以芳樟醇為主)、 腦樟(以樟腦為主)、 油樟(以桉葉油素為主)、 異樟(以異花叔醇為主)和龍腦樟(以龍腦為主)5種化學型[4,5]. 芳樟醇是香水香精、 家化產品香精等配方中使用頻率最高的香料品種, 也是全世界年用量最多的香料之一[6,7]; 天然樟腦有局部麻醉作用, 具有利滯氣、 辟穢濁、 殺蟲止癢和消腫止痛等功效[8]; 龍腦又稱天然冰片, 具有開竅醒神、 清熱解毒和明目退翳等功效, 常被添加到藥物中[9]. 由于不同化學型樟樹所含揮發性成分差異較大, 因此鑒定其化學型對于有效開發樟樹資源具有積極作用.

不同化學型的樟樹在形態上無明顯差異, 生產實踐中主要依靠人為嗅覺經驗確定其化學型[4], 不但判斷正確率受限制, 也不利于發現新的化學型. 由于樟樹葉精油類型成分穩定, 不受樹齡影響, 且具有較高的遺傳能力, 所以通常把樟樹葉精油的成分差異作為區別樟樹化學型的標準[10,11]. 目前, 植物化學型的研究方法包括基于遺傳學差異的分子標記技術[12～14]和基于化學組成, 尤其是精油差異的分析化學技術, 包括氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)法[14,15]、 氣相色譜-火焰離子化檢測(GC-FID)法[16,17]、 高壓液相色譜法(HPLC)法[18,19]和紅外光譜(IR)法等[20,21]. 然而, 這些方法不僅操作繁瑣、 靈敏度不高, 而且在樣品提取過程中使用的有機試劑可能造成樣品成分破壞或提取不完全, 難以實現對大批量樣品的快速、 有效分析. 因此, 建立一種可快速、 有效判別植物化學型的方法十分必要.

表面解吸常壓化學電離質譜(SDAPCI-MS)是一種直接質譜技術, 它無需樣品預處理過程, 即可完成樣品的快速分析, 且分析過程中無需使用有毒化學試劑, 對樣品表面無污染; 由于初級離子產生密度較高, 對弱極性和非極性物質的檢測能力也較高[22]. 目前, SDAPCI技術已被用于食品安全[23～25]、 藥品及醫學[26～28]以及國土安全和植物學[29～31]等領域分析, 而將直接質譜技術應用于植物化學型的判別研究尚無相關報道. 本文以5種化學型的樟樹葉粉末樣品壓片為實驗材料, 采用SDAPCI-MS獲得不同化學型樟樹的譜圖信息, 實現了對不同樟樹化學型的快速判別.

1 實驗部分

1.1 儀 器

Fig.1 Schematic illustration of SDAPCI-MS ofcamphor leaves tablet

SDAPCI離子源由東華理工大學研制, 裝置圖示于圖1; LTQ-XL增強型線性離子阱質譜儀(美國Finnigan公司), 配有Xcalibur數據處理系統; YP-2型壓片機(上海山岳科學儀器有限公司).

1.2 實驗過程

1.2.1 樣品準備 樟樹葉樣品采自江西省林業科學院實驗地, 由江香梅研究員提供并鑒定, 且經靜態頂空GC-MS結合判別分析等多變量分析方法[32]驗證了其化學型, 包括異樟、 腦樟、 油樟、 芳樟和龍腦樟5種. 采集時間為2011年10月上旬, 樹齡為8～10年; 所采樣品為當年生長出來的新葉, 顏色墨綠色; 采集后隨即陰干, 粉碎, 過60目篩后壓片(壓力35 MPa, 直徑10.0 mm, 厚度1.5～2.5 mm)、 封袋, 常溫下保藏備用.

1.2.2 質譜分析 分別取每種化學型樟樹葉粉末壓片各30片進行檢測. 將壓片置于載玻片上, 放置在SDAPCI離子源下, 直接進行質譜分析. 正離子檢測模式, 質量范圍為m/z50～300, 電離電壓3.6 kV, 離子傳輸管溫度180 ℃, 放電針與水平面夾角α約為45°, 針尖與質譜口毛細管平行, 距離約10.0 mm, 片劑上表面距放電針尖和距質譜口均約為7.0 mm. 在電場作用下, 電暈放電產生的大量初級離子轟擊樟樹葉片劑的中心點, 使樣品解吸和電離, 形成的離子被吸入質譜儀進行分析, 每片進樣5次. 進行串聯質譜分析時, 設定母離子寬度為1.2 Da, 碰撞能量為25%, 碰撞時間為30 ms, 其它實驗參數由系統自動優化.

1.3 數據統計學分析

1.3.1 主成分分析 將采集得到的質譜數據按質荷比規整為整數. 以質荷比為獨立變量, 相應信 號強度為變量值, 得到一個(450×125)的樣本數據矩陣. 通過Matlab7.8.0(R2009a)軟件內置的Princomp函數對樣本數據進行主成分分析, 計算得出各個主成分變量及其特征值、 特征向量、 貢獻率和載荷.

1.3.2 聚類分析 為觀察各樣品間的親疏關系, 對每種化學型樟樹隨機抽出1個樣品, 將該樣品的質荷比數據輸入Matlab 7.8.0(R2009a)軟件的CA分析程序中, 計算樣本之間的歐式距離, 進行分層聚類分析.

1.3.3 反向神經網絡 為了對5類樟葉進行判別分析, 建立1個3層的人工神經網絡結構, 各層傳遞函數均采用S(Sigmoid)型函數. 網絡輸入層節點數為250, 經多次實驗確定隱含層節點數為39, 輸出層節點數為1. 目標誤差為0.01, 網絡指定參數中學習速率為0.20, 設定訓練迭代次數閾值為1000次. 上述數據處理方法均采用Matlab7.8.0(R2009a)軟件編程實現.

2 結果與討論

2.1 樟樹樣品的SDAPCI-MS分析

SDAPCI-MS對小分子物質較敏感, 尤其是對揮發性物質的靈敏度較高, 利用該技術獲得了芳樟、 龍腦樟、 腦樟、 油樟和異樟5種化學型樟葉成分的指紋特征譜圖(圖2). 不同化學型樟樹葉的SDAPCI-MS譜圖存在明顯差異, 其中油樟的信號峰最少, 異樟的最多, 說明油樟成分較少, 異樟成分最多, 與其它方法檢測所得樟樹化學成分特征[32]基本一致; 信號峰m/z137, 153和170等在各化學型中均有較強且不等的豐度, 所有樣品在m/z120～200之間產生的信號譜峰較集中, 質譜信號較復雜. 采用GC-MS等方法[5,33,34]檢測樟樹揮發油主要成分為相對分子量為136的烯烴類化合物和相對分子量為154的醇類化合物; 在SDAPCI-MS正離子模式下, 這些化合物形成m/z137和m/z155信號峰. 說明樟樹葉中揮發性成分穩定, 用不同方法都能檢測到其特征揮發性成分.

Fig.2 SDAPCI-MS spectral fingerprints of 5 chemotypes of C. camphora leaves (A) Linalool-type; (B) borneol-type; (C) camphora-type; (D) cineole-type; (E) isoborneol-type.

為了進一步解吸樟樹葉中的物質組成, 對m/z153離子進行串聯質譜定性分析, 如圖3所示, 主要碎片離子為m/z135, 109, 107和95, 分別為m/z153去掉1分子H2O, C2H4O, C2H6O和C3H6O所致, 經與文獻[31]比較, 確認該物質為樟腦.

Fig.3 SDAPCI-MS2(A) and MS3(B) spectra of precursor ions of m/z 153

2.2 主成分分析

根據5種化學型樟樹葉SDAPCI-MS圖譜的PCA得分可知, PC1, PC2和PC3的貢獻率分別為79.9%, 12.9%和4.2%, 共計97.0%. 如圖4(A)和(B)所示, 沿PC1方向, 油樟與其它4種化學型樟樹可以完全分開. 在PC1載荷圖(圖5)的主要離子為m/z153, 為樟腦. 因此, PC1主要反映了樟腦含量用于區別油樟與其它4種化學型. 研究[5,32]表明, 樟腦在腦樟型樟樹葉中含量最高, 最高可達40.0%; 而在油樟中含量較少, 有的只有0.6%, 一般不超過1.0%.

Fig.4 PCA results of 5 chemotypes of C. camphora leaves using SDAPCI-MS Linalool-type; borneol-type; camphora-type; cineole-type; isoborneol-type.

Fig.5 Corresponding PCA loading plots

如圖4(A)與 (C)所示, 沿著PC2方向, 腦樟和芳樟完全分離, 在PC2載荷圖(圖5)中的主要離子為m/z137, 170和188. 因此, PC2主要反映了m/z137, 170和188的差異用于區別腦樟和芳樟. 如圖4(B)和(C)所示, 在PC3方向, 異樟與其它4種化學型樟樹分開, 說明PC3主要用于區別異樟與其它4種化學型. 比較圖4(A)～(D)可知, 5種化學型樟樹的質譜數據經PCA處理后, 樣本在主成分1～3的3個投影方向的得分圖區分效果最好, 說明僅靠前3個主成分得分所構成的特征向量即可達到良好的分類效果.

2.3 聚類分析

由圖6可知, 當聚類分析的距離臨界值取4時, 25個樟樹葉樣品分別聚為5類; 每一類包括5個樣品, 在圖6上依次為異樟、 芳樟、 龍腦樟、 油樟和腦樟. 聚類準確率為100%. 當距離臨界值取6時, 25個樟樹樣品可聚為2大類, 其中異樟單獨為一類, 其它4種化學型聚為一類.

Fig.6 Dendrogram of cluster analysis (A1—A5) Linalool-type; (B1—B5) borneol-type; (C1—C5) camphora-type; (D1—D5) isoborneol-type; (E1—E5) cineole-type.

2.4 反向神經網絡分析

Fig.7 Training procedure chart of BP network Best validation performance is 1.0581×10-6 at epoch 110.

為了進一步分析不同化學型樟樹葉的差異, 將5種化學型樟樹葉樣品分為5類供網絡學習. 每種化學型選150個樣本, 隨機樣本作為訓練集和檢測集, 剩余樣本用于驗證, 同一圖中分別繪出訓練誤差、 驗證誤差和測試誤差曲線(見圖7), 從而更直觀地觀察到訓練過程. 該模擬訓練過程中的均方誤差(MSE) 值經116次迭代計算后MSE 低于10-6, 滿足模型的預測要求. 如表1所示, 用此方法構造的分類器模型對預測集進行預測, 對750個變量做了分析, 結果顯示測試和訓練及總體準確率均為100%.

Table 1 Accuracy of C. camphora leaves using BP network

2.5 分析速度及方法穩定性

實驗設定全譜掃描時間為100 ms, 每個樣品連續進樣5次, 約為2 min, 計算得正離子模式下芳樟樣本信號m/z137的相對標準偏差(RSD)為4.65%, 表明SDAPCI-MS在無需樣品預處理的情況下, 能夠實現對樟樹葉樣品的高通量分析, 檢測效果較穩定, 具有較好的重復性.

3 結 論

利用SDAPCI-MS技術檢測樟樹葉粉末片劑, 可以獲得不同化學型樟樹的質譜特征信號, 這些質譜信號體現了不同化學型樟樹葉成分的差別. 再結合PCA, CA和BP-ANN對SDAPCI-MS數據進行處理, 對5種化學型樟樹葉實驗樣品的判別率均為100%, 說明不同化學型樟樹可被有效區分. 本方法分析速度快、 信息提取準確且識別精度高, 為植物化學型鑒別提供了一種新手段.

[1] Rovesti P.,Pharm.Weekbl., 1957, 92(23), 843—845

[2] Ouyang S. L., Luo Z. H., Zhou X. Q., Lin S. F.,ChineseJ.ExperimentalTraditionalMedicalFormulae, 2011, 17(18), 268—271(歐陽少林, 羅志華, 周小卿, 林淑芳. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(18), 268—271)

[3] Zhu L. F.,J.PlantResour.Environ., 1994, 3(2), 51—55(朱亮鋒. 植物資源與環境學報, 1994, 3(2), 51—55)

[4] Li X. W.,FloraReipublicaePopularisSinicae, Science Press, Beijing, 1982, 31, 182—189(李錫文. 中國植物志, 北京: 科學出版社, 1982, 31, 182—189)

[5] Zhang G. F., Chen C. J., Chen Z. P., Chen R. Y., Lin X. S.,J.PlantResour.Environ., 2008, 17(1), 24—27(張國防, 陳存及, 陳志平, 陳瑞炎, 林賢松. 植物資源與環境學報, 2008, 17(1), 24—27)

[6] Fenn R. S.,Perfumer&Flavorist, 1989, 14(2), 1—10

[7] Yang F., Long E. P., Wen J. H., Cao L., Zhu C. C., Hu H. X., Ruan Y., Okanurak K., Hu H. L., Wei X. X., Yang X. Y., Wang C. F., Zhang L. M., Wang X. Y., Ju P. Y., Zheng H. Q., Wu Z. D., Lv Z.Y.,Parasite.Vector., 2014, 7(1), 445—457

[8] Hu W. J., Gao H. D., Jiang X. M., Yang H. K.,J.CentralSouthUniversityofForestry&Technology, 2012, 32(11), 186—194 (胡文杰, 高捍東, 江香梅, 楊海寬. 中南林業科技大學學報, 2012, 32(11), 186—194)

[9] Singh R.,Pharmacogn.J., 2012, 4(28), 1—5

[10] Shi W. Y., He W., Wen G. Y., Guo D. X., Long G. Y., Liu Y. K.,ActaBatanicaSinica, 1989, 31(3), 209—214(石皖陽, 何偉, 文光裕, 郭德選, 龍光遠, 劉銀苛. 植物學報, 1989, 31(3), 209—214)

[11] Hu W. J.,VariationsoverTimeandAcrossDifferentPartsofTreeandSelectionofOptimumIndividualPlantfromMainComponentsofDifferentChemicalTypesOilinC.camphora, Nanjing Forestry University, Nanjing, 2013(胡文杰. 樟樹不同化學型精油主成分時空變異規律及優良單株選擇, 南京: 南京林業大學, 2013)

[12] Echeverrigaray S., Agostini G., Atti-Serfini L., Paroul N., Pauletti G. F., dos Santos A. C.,J.Agri.FoodChem., 2001, 49(9), 4220—4223

[13] Jiang X. M., Wu Y. F., Xiao F. M., Xiong Z. Y., Xu H. N.,Hereditas, 2014, 36(1), 58—68(江香梅, 伍艷芳, 肖復明, 熊振宇, 徐海寧. 遺傳, 2014, 36(1), 58—68)

[14] Ma L.,TheEssentialOilChemotypesandISSRAnalysisofGenticRelationshipsofSevenVarietiesofThyme, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 2009(馬莉. 7種百里香精油的化學型及其遺傳關系的ISSR分析, 上海: 上海交通大學, 2009)

[15] Wang Y.,ComparativeStudyonTwoChemicalTypesofRosemary, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 2010(王越. 兩種化學型迷迭香的對比研究, 上海: 上海交通大學, 2010)

[16] Keefover-Ring K., Thompson J. D., Linhart Y. B.,FlavourFrag.J., 2009, 24(3), 117—122

[17] Rodríguez-Solana R., Salgado J. M., Domínguez J. M., Cortés-Diéguez S.,Phytochem.Analysis, 2015, 26(1), 61—71

[18] Vieira R. F., Grayer R. J., Paton A. J.,Phytochem., 2003, 63(5), 555—567

[19] Peschel W., Politi M.,Talanta, 2015, 140, 150—165

[20] Zhang Z. J., Zhang G. Z., Wang P. P.,ChinaMed.Pharmacy, 2015, 5(1), 86—91 (張志軍, 張桂芝, 王朋朋. 中國醫藥科學, 2015, 5(1), 86—91)

[21] Luo C. P., He T., Guo Z.,Chin.J.Appl.Environ.Biol., 2013, 19(3), 537—541(羅聰佩, 何濤, 郭澤. 應用與環境生物學報, 2013, 19(3), 537—541)

[22] Chen H. W., Lai J. H., Zhou Y. F., Huan Y. F., Li J. Q., Zhang X., Wang Z. C., Luo M. B.,Chin.J.Anal.Chem., 2007, 35(8), 1233—1240(陳煥文, 賴勁虎, 周瑜芬, 郇延富, 李建強, 張燮, 王志暢, 羅明標. 分析化學, 2007, 35(8), 1233—1240)

[23] Song Q. H., Wang J., Hu B., Chen H. W., Jin Q. H.,Chem.J.ChineseUniversities, 2010, 31(10), 1961—1964(宋慶浩, 王姜, 胡斌, 陳煥文, 金欽漢. 高等學校化學學報, 2010, 31(10), 1961—1964)

[24] Yang S. P., Ding J. H., Zheng J., Hu B., Li J. Q., Chen H. W., Zhou Z. Q., Qiao X. L.,Anal.Chem., 2009, 81(7), 2426—2436

[25] Luo L. P., Wang J., Zhang W. J., Dai X. M., Fang X. W., Zhang X., Liu Y. L., Chen H. W.,ChineseJ.Anal.Chem., 2013, 41(7), 1050—1056(羅麗萍, 王姜, 章文軍, 戴喜末, 方小偉, 張茜, 劉亞麗, 陳煥文. 分析化學, 2013, 41(7), 1050—1056)

[26] Li J. Q., Jia B., Hu B., Chen H. W., Zeng X. T., Xiao R. H.,ChineseJ.Anal.Chem., 2010, 38(9), 1325—1328(李建強, 賈濱, 胡斌, 陳煥文, 曾祥泰, 肖日海. 分析化學, 2010, 38(9), 1325—1328)

[27] Wang J., Li Q., Gu H. W., Guo X. T., Yang S. P., Wang Z. H.,Chem.J.ChineseUniversities, 2015, 36(6), 1067—1073(王姜, 李倩, 顧海巍, 郭曉暾, 楊水平, 王志豪. 高等學校化學學報, 2015, 36(6), 1067—1073)

[28] Zhang X. L., Jia B., Huang K. K., Hu Bin., Chen R., Chen H. W.,Anal.Chem., 2010, 82(19), 8060—8070

[29] Huang D. J., Luo L. P., Jiang C. C., Han J., Zhang T. T., Jiang J., Zhou Z. Q., Chen H. W.,J.Agric.FoodChem., 2011, 59(6), 2148—2156

[30] Pi Z. P., Yue H., Ma L., Ding L. Y., Liu Z. Q., Liu S. Y.,Anal.Chim.Acta, 2011, 706(2), 285—290

[31] Zhu L., Yan J. P., Zhu Z. Q., Ouyang Y. Z., Zhang X. L., Zhang W. J., Dai X. M., Luo L. P., Chen H. W.,J.Agri.FoodChem., 2013, 61(3), 547—552

[32] Liu X. X., Zhang X., Guo X. L., Gong S. J., Jiang X. M., Fu Y. X., Luo L. P.,ChineseBulletinofBotany, 2014, 49(2), 161—166 (劉星星, 張茜, 郭夏麗, 龔上佶, 江香梅, 付宇新, 羅麗萍. 植物學報, 2014, 49(2), 161—166)

[33] Zhou X., Mo J. G., Xie Y. X., Li A. F.,FoodSci.Tech., 2011, 36(1), 282—285(周翔, 莫建光, 謝一興, 李奧峰. 食品科技, 2011, 36(1), 282—285)

[34] Chen H. P., Yang K., You C. X., Lei N., Sun R. Q., Geng Z. F., Ma P., Cai Q., Du S. S., Deng Z. W.,J.Chem., 2014, (2014), 1—5

Rapid Discrimination of Chemotypes ofCinnamomumcamphoraby

(Ed.: N, K)

? Supported by the “Twelve Five” Issues in Rural Areas of National Science and Technology Plan Project, China(No. 2012BDA29B01-3), the National Natural Science Foundation of China(No. 31370384), the Floor Plan of Scientific and Technological Projects in Jiangxi Province, China(No. KJLD12051)， the Science and Technology Planning Project at the Ministry of Science and Technology of Jiangxi Province, China(No.20142BCB24005) and the Autonomous Research Projects of State Key Laboratory of Food Science and Technology in Nanchang University, China(No. SKLF-ZZB-201516).

Surface Desorption Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry?

LIU Xingxing1, FANG Xiaowei2, HUANG Xueyong1, ZHANG Tingting1,CHEN Huanwen2, LUO Liping1*

(1.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,NanchangUniversity,Nanchang330047,China;2.JiangxiKeyLaboratoryforMassSpectrometryandInstrumentation,EastChinaInstituteofTechnology,Nanchang330013,China)

Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry(SDAPCI-MS) was selected to detect five chemotypes ofC.camphoraleaves powder and the raw mass spectral fingerprints of the powder samples were obtained. Principal component analysis(PCA), cluster analysis(CA) and the back propagation artificial neural network technology(BP-ANN) were used to analyze the spectral information. The results showed that the SDAPCI-MS technique could got mass spectral fingerprints ofC.camphoraquickly in positive ion mode. The contribution rates of PC1, PC2, PC3 were 79.9%, 12.9% and 4.2%, respectively, with a total of 97.0% in PCA. The accuracy of discrimination of CA and BP-ANN of SDAPCI-MS was 100%.

Cinnamomumcamphora; Chemotype; Surface desorption atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry(SDAPCI-MS); Multivariate analysis

10.7503/cjcu20150684

2015-09-01;

日期: 2016-01-13.

“十二五”農村領域國家科技課題(批準號: 2012BDA29B01-3)、 國家自然科學基金(批準號：31370384)、 江西省高等學校科技落地計劃項目(批準號: KJLD12051)、 江西省科技計劃項目(批準號：20142BCB24005)和南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題(批準號: SKLF-ZZB-201516)資助.

O657

A

聯系人簡介: 羅麗萍, 女, 博士, 教授, 博士生導師, 主要從事植物代謝產物方面的研究. E-mail: lluo2@126.com