用于糖鏈抗原CA19-9實時動態活檢的免疫雙光子熒光標記試劑盒

黃池寶, 張道海, 曾伯平, 劉其斌,陳華仕, 康 帥, 陳曉遠

(1. 遵義師范學院化學化工學院, 遵義 563002; 2. 韶關大學農業科學與工程學院, 韶關 512005;3. 貴州大學材料與冶金學院, 貴陽 550025)

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用于糖鏈抗原CA19-9實時動態活檢的免疫雙光子熒光標記試劑盒

黃池寶1,2, 張道海3, 曾伯平1, 劉其斌3,陳華仕1, 康 帥1, 陳曉遠2

(1. 遵義師范學院化學化工學院, 遵義 563002; 2. 韶關大學農業科學與工程學院, 韶關 512005;3. 貴州大學材料與冶金學院, 貴陽 550025)

采用雙光子熒光標記探針LP制備了免疫雙光子熒光抗體LP-Ab, 以特異性識別腫瘤標志物CA19-9(Ag)形成抗原-抗體復合物(LP-Ab·Ag), 基于雙光子誘導熒光機制用近紅外激光(740 nm)激發LP-Ab·Ag, 利用LP-Ab·Ag的雙光子熒光實現了CA19-9的高清晰度、 高靈敏度及高分辨率的量化檢測和實時動態成像, 并制成用于糖鏈抗原CA19-9檢測的簡單便捷的雙光子熒光標記試劑盒.

糖鏈抗原CA19-9; 抗CA19-9單克隆抗體(Ab19-9); 免疫熒光標記; 雙光子; 活檢

糖鏈抗原CA19-9(Carbohydrate antigen 19-9, Ag) 是一種與胰腺癌、 膽囊癌、 結腸癌和胃癌相關的腫瘤標識物[1～4]. 抗CA19-9單克隆抗體為1116 NS 19-9[5], 簡稱Ab19-9(Ab). CA19-9測定廣泛用于結腸直腸癌、 胃癌、 胰癌、 肝細胞癌、 肺癌及乳癌的臨床監測與診斷. 因此, 開展快速、 專一、 可靠地檢測體內糖鏈抗原方法的研究, 對于早期腫瘤與癌癥的診治及預警具有重要的理論和現實意義.

目前有關CA19-9的檢測方法[6～8]的專一性、 靈敏度及穩定性較差, 且操作繁瑣, 檢測試樣限于血液與外周血. 直接免疫熒光法具有特異性強、 靈敏度高、 速度快和無放射性污染(與放射免疫法相比)等特點, 且其操作簡便、 便于推廣[9]. 單光子熒光激發波長通常為350～560 nm[10,11], 易產生光致毒與光漂白[12,13]; 而雙光子熒光采用800～1100 nm的高強度激光作為激發光源, 不僅能克服單光子熒光的缺點, 還能實現深層暗場成像及定點激發, 避免組織自發熒光干擾以及降低組織吸光系數, 從而顯著提高成像的清晰度、 檢測的靈敏度與分辨率[14～18].

芴衍生物具有較高的熒光量子產率和極佳的光穩定性[19,20], 且顯示出優良的雙光子吸收性能及較高的雙光子吸收截面[21～25]. 特別是A-π-π-π-A(A為吸電子分支,π為含π鍵的共軛體系)型芴衍生物的熒光量子產率接近1, 雙光子吸收截面高達約1185 GM[22,25]. Morales等[26]利用芴衍生物的雙光子吸收優勢, 引入二甘醇基團以提高化合物的水溶性, 開發出可用于生物標記的雙光子熒光探針LP, 用其分別標記環肽C(RGDfK)和血清球蛋白G(IgG), 并用于COS-7細胞與HeLa細胞的成像研究.

本文選用LP標記抗CA19-9抗體Ab19-9, 制備了免疫雙光子熒光抗體LP-Ab19-9, 利用抗原-抗體特異性識別原理和雙光子誘導熒光機制, 實現了腫瘤標志物CA19-9的高清晰度、 高靈敏度及高分辨率的實時動態活檢, 并制成用于CA19-9檢測的簡單便捷的雙光子熒光標記試劑盒, 可方便快速地進行門診化驗與篩選. 拓寬了LP探針的應用范圍, 也實現了腫瘤標志物CA19-9的實時動態檢測.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

抗體Ab19-9(Ab, 上海江萊生物科技有限公司); PBS緩沖溶液(1.35 mol/L NaCl+47 mmol/L KCl+100 mmol/L Na2HPO4+20 mmol/L NaH2PO4, pH=7.4, 上海博谷生物科技有限公司); 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100, 化學純, 廣州市應泓化工有限公司); 培養基和膠原酶Ⅰ(北京索萊寶科技有限公司); 胎牛血清(FBS, 江蘇雨桐生物科技有限公司); 牛血清白蛋白(BSA, 北京政博偉業生物科技有限公司); 乙二醇-雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA, 南京安培化工科技有限公司);N,N′-雙(2-乙磺酸)哌嗪(PIPES, 南京安培化工科技有限公司);N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磷酸(HEPES, 南京安培化工科技有限公司); 所用試劑和溶劑均為分析純, 試劑在使用前均經除水精制.

VARIAN INOVA 400 MHz核磁共振儀(美國Varian公司); HP 8453型紫外-可見分光光度儀(美國惠普公司); RF-5000型熒光分光光度儀(日本島津公司); MD29 Spectra-max190型分光光度計(美國Molecular Devices公司); HP1100LC/ESI-MSD型電噴霧質譜儀(美國Agilent公司); FT/IR-430型紅外光譜儀(波數掃描范圍為350～7800 cm-1, KBr壓片法, 日本Jasco公司); Perkin2400(Ⅱ)型元素分析儀(美國Perkin公司); Mira 900-F型鎖模飛秒鈦藍寶石激光器(激光脈沖寬度120 fs, 重復頻率76 MHz, 激光器的平均輸出功率1.5 W, 可調波長范圍為700～980 nm, 美國Coherent公司).

Fig.1 Molecular structure of LP

1.2 標記探針LP的合成

雙光子熒光標記探針LP參照文獻[26]方法合成, 黃色固體(結構見圖1), m.p. 216～217 ℃, HRMS(EI)(C55H45N3O6S2計算值),m/z: 907.2806(907.2750).

2 結果與討論

2.1 探針LP標記抗糖鏈抗原抗體

將2 mg(約10-5mmol)抗體Ab溶于0.5 mL二甲亞砜(DMSO)中, 用0.1 mol/L NaHCO3溶液將pH調至9, 將LP(10 μg, 1.1×10-5mmol)加入反應混合液中, 攪拌反應24 h. 反應結束后, 加入4倍混合液體積的乙醚稀釋反應混合物, 析出沉淀, 過濾得固體, 再加入DMSO直至剛好溶解為止, 向溶解液中加入乙醚直至不再有沉淀析出, 過濾, 干燥, 得黃色固體(約1.8 mg), 即為標記抗體LP-Ab.

2.2 腫瘤單細胞懸液的制備

將FBS(100 g/L)、 青霉素(100 Units/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)加入到細胞培養基DMEM中并混合均勻, 在此溶液中培養小鼠卵巢腫瘤細胞. 先將新鮮小鼠卵巢腫瘤組織剪碎成大小為1 mm3的碎塊, 再加入膠原酶Ⅰ型(1 g/L)消化, 每30 min消化1次, 將消化下來的懸浮細胞用含血清的培養液中和胰酶, 離心并用培養液重懸細胞, 于4 ℃下保存, 待消化完全后, 將消化后的細胞懸液通過160～200目的篩網, 即得單細胞懸液. 將單細胞懸液接種到培養瓶中, 貼壁1.5 h后, 除去貼壁細胞(主要是成纖維細胞、 內皮細胞和巨噬細胞等), 得到較純的備用腫瘤細胞. 成像前2 d進行細胞篩選處理. 采用同樣方式制備小鼠胰腺腫瘤細胞.

成像操作前, 先除去培養介質再換成含Triton X-100(質量分數0.05%)的PHEMO緩沖液(68 mmol/L PIPES+25 mmol/L HEPES+15 mmol/L EGTA+3 mmol/L MgCl2+質量分數10%的DMSO).

2.3 標記抗體LP-Ab的吸收光譜與熒光光譜

標記抗體LP-Ab(吸收光譜和發射光譜的測定濃度分別為10和1 μmol/L)在含Triton X-100(質量分數0.05%)的PHEMO緩沖液中的最大吸收波長與發射波長分別為413 nm和485 nm(圖略), 斯托克斯位移(Stokes shift)為72 nm, 吸收光譜與發射光譜在400～475 nm范圍內有部分重疊, 但分隔得較清楚, 對熒光測試干擾較小. 采用雙光子激發可以更大程度地消除這種激發光對發射光的影響. 經測定, LP-Ab的熒光量子產率為0.68, 具有較強的熒光, 可以提高檢測的靈敏度與成像的清晰度.

2.4 標記抗體LP-Ab的雙光子激發譜及雙光子吸收截面

Fig.2 Two-photon action spectra of LP(a, 10 μmol/L) and LP-Ab(b, 10 μmol/L)

參照文獻[27～30]方法測定了標記抗體LP-Ab(10 μmol/L)在含Triton X-100(質量分數0.05%)的PHEMO緩沖液中的雙光子發射譜(如圖2所示). 可見, 當雙光子激發波長為740 nm時, LP-Ab的雙光子吸收截面最大(960 GM), 且隨雙光子激發波長的增大而逐漸降低. 開始時雙光子吸收截面隨著波長增大降低速度較快, 之后降低速度顯著變小. 因此, 選擇740 nm作為雙光子激發波長.

2.5 腫瘤細胞的實時動態活檢

將腫瘤細胞用1 μmol/L LP-Ab在組織培養室中[CO2(體積分數5%), 37 ℃]孵化30 min, 用PBS緩沖液洗滌3次, 于無色血清游離介質中再孵化15 min后進行成像操作. 圖3為用標記抗體LP-Ab標記的腫瘤細胞的雙光子共聚焦熒光顯微照片, 激發波長為740 nm, 收集450～500 nm通道的熒光.

Fig.3 TPM images of 1 μmol/L LP-Ab-labeled mouse pancreatic carcinoma cells collected at 450—500 nm(A) Magnification at 10×; (B) magnification at 40×. The images were collected upon excitation at 740 nm with a femtosecond pulse. Cells shown are representative images from replicate experiments(n=5).

2.6 免疫雙光子熒光標記試劑盒

免疫雙光子熒光標記試劑盒由雙光子熒光標記抗體LP-Ab(10 μmol/L)、 硝酸纖維素膜、 封閉緩沖液[PBS(20 mmol/L, pH=7.4) + BSA(0.5 g/L)]和洗滌緩沖液 [含吐溫20(質量分數0.05%)的 PBS溶液(50 mmol/L, pH=7.4)]組成. 雙光子熒光標記試劑盒的操作步驟如下: 先用PBS稀釋緩沖液(20 mmol/L, pH=7.4)將樣品稀釋至一定濃度, 并在硝酸纖維素膜上滴加2～6 μL 1 μmol/L標記抗體LP-Ab, 各點間相隔1～2 cm的距離, 于4 ℃下吸附0.5～1 h. 然后, 用多聚甲醛(質量分數4%)浸潤硝酸纖維素膜15 min, 用PBS緩沖液浸洗硝酸纖維素膜(3 min×3). 將硝酸纖維素膜直接浸入封閉緩沖液內, 于37 ℃溫育0.5～2 h. 用洗滌緩沖液清洗硝酸纖維素膜至少3次, 靜置干燥后加入2～6 μL血清樣品, 于37 ℃溫育0.5～2 h; 再次用洗滌緩沖液清洗硝酸纖維素膜至少3次, 取出膜片用干凈的吸水紙去除表面殘余的液體. 最后, 將硝酸纖維素膜平鋪在干凈的玻璃片上, 在雙光子熒光顯微鏡下觀察檢測結果, 如圖4所示. 若觀察到熒光, 則樣品中含有抗原Ag, 說明存在腫瘤, 檢測顯陽性; 否則樣品不含抗原, 樣品正常, 檢測顯陰性, 如圖5所示.

Fig.4 Negative(A) and positive(B) fluorescent images of 1 μmol/L LP-Ab-labeledmouse pancreatic carcinoma and normal cells under the eyepiece

Fig.5 Diagram of two-photon fluorescent labeling kit

綜上， 本文用雙光子熒光標記探針LP標記抗CA19-9抗體Ab19-9， 制備了免疫雙光子熒光抗體LP-Ab19-9; 實現了腫瘤標志物CA19-9的高清晰度、 高靈敏度與高分辨率的實時動態活檢; 將其制成用于CA19-9檢測的雙光子熒光標記試劑盒, 可方便快速地進行門診化驗與篩選.

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(Ed.: P, H, N, K)

Two-photon Fluorescent Labeling Kit for the Real-time Dynamic Biopsy of CA19-9?

HUANG Chibao1,2*, ZHANG Daohai3, ZENG Boping1, LIU Qibin3, CHEN Huashi1,KANG Shuai1, CHEN Xiaoyuan2

(1.ChemistryandChemicalEngineeringCollege,ZunyiNormalUniversity,Zunyi563002,China;2.CollegeofAgriculturalScienceandEngineering,ShaoguanUniversity,Shaoguan512005,China;3.CollegeofMaterialsandMetallurgy,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China)

Carbohydrate antigen CA19-9(Ag) is a tumor marker associated with pancreatic cancer, gallbladder cancer, colon cancer and gastric cancer in early stage of tumor and cancer stage. Antibody Ab19-9(Ab) to carbohydrate antigens were labeled to form probe-labeled antibody LP-Ab using the prepared two-photon fluorescence probe LP. On the basis of the antigen-antibody specificity affinity principle, LP-Ab could combine with carbohydrate antigen Ag into a complex LP-Ab·Ag, which was excited by near infrared laser(740 nm) and emitted strong two-photon fluorescence to accomplish the high sensitive biopsy and real-time dynamic high-resolution imaging of the tumor marker Ag with two-photon fluorescence microscope. Based on this, a simple and convenient two-photon fluorescent labeling kit was prepared to realize the rapid detection of tumor, which is convenient for large-scale clinic testing and screening. The research further broadens the application of LP, and provides a sharp tool for revealing the mechanism of cancer occurrence, development and metastasis. LP-Ab can be used to observe and study the dynamic transfer mechanisms of the tumor markers in cells and the mechanism of carcinogenesis.

Carbonhydrate antigen CA19-9; Antibody Ab19-9; Immunofluorescence labeling; Two-photon; Biopsy

10.7503/cjcu20150727

2015-09-17.

日期: 2016-03-10.

國家自然科學基金(批準號: 21562050, 11464052)、 貴州省第八批科技創新人才團隊建設專項基金[批準號: 黔科合人才團隊(2015)4007]、 貴州省科學技術基金項目(批準號: 黔科合J字[2015]2146, [2012]2345)、 貴州省教育廳自然科學重點研究項目(批準號: 黔教合KY字[2014]296, [2013]171)、 貴州省教育廳省級本科教學工程建設項目(批準號: 黔教[2014]JXGChcb)、 遵義市“15851人才精英工程”項目[批準號: (2015)4007]和遵義市紅花崗區科學技術項目(批準號: 遵紅科合社字[2015]18)資助.

O657

A

聯系人簡介: 黃池寶, 男, 博士, 教授, 主要從事雙光子熒光探針研究. E-mail: huangchibao@163.com

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos. 21562050, 11464052), the Special Fund Project of the Construction of the Eighth Batch of Scientific and Technological Innovation Talent Team in Guizhou Province, China[No.(2015)4007], Guizhou Provincial Science and Technology Fund Project, China(Nos.J[2015]2146, J[2012]2345), the Key Project of Education Department of Guizhou Province(Nos.KY[2014]296), KY(2013)171), the Teaching Contents and Curriculum System Reform Project of Higher Education in Guizhou Province, China(No.KY [2014] JXGChcb), the Project of “15851 Talents Elite Project” in Zunyi City, China[No.(2015)4007] and the Science and Technology Project of Zunyi City Honghuagang District, China(No.[2015]18).