巨噬細胞刺激因子（MSF）與巨噬細胞抑制因子（MIF）對視網膜節細胞軸突再生的影響

岑令平，梁嘉健，張銘志

巨噬細胞刺激因子（MSF）與巨噬細胞抑制因子（MIF）對視網膜節細胞軸突再生的影響

岑令平，梁嘉健，張銘志

目的研究巨噬細胞刺激因子（macrophage stimulating factor，MSF）及巨噬細胞抑制因子（macrophage inhibitory factor，MIF）對視網膜節細胞（retinal ganglion cell，RGC）軸突再生的影響。方法實驗性研究。費希爾大鼠9只，施行視神經損傷術7 d后取出眼球并剝離視網膜，把剝離下來的視網膜平鋪，放射狀剪成8片，每一片視網膜粘鋪于已包被好的培養板孔中，分為對照組、MSF組、MIF組，分別加入培養基及MSF/MIF等處理因素試劑；培養7 d后對視網膜培養塊進行固定及免疫熒光染色，分別計數RGC再生神經軸突的數量及長度和外遷巨噬細胞的數量。結果與對照組相比，MSF及MIF可以一定程度上分別增多及減少遷移巨噬細胞的數量（P＞0.05），與此同時，MIF可以減少RGC再生神經軸突的數量及長度（P＜0.05），MSF雖未能增加神經突的長度，但還是有效地增加了再生神經突的數量（P＜0.05）。結論MSF可以促進RGC神經軸突的再生，與此相反MIF可以抑制神經軸突的再生。

視網膜節細胞；巨噬細胞；視神經損傷；存活；神經再生

視神經損傷嚴重影響視覺功能，甚至可以導致視力喪失而致盲。視神經損傷會引起大量視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell，RGC）繼發性凋亡，從而導致視力損害。研究表明，在大鼠視神經被橫切3周后，只有約10%的RGC能存活下來〔1〕。視神經屬于中樞神經系統的一部分，在損傷后缺乏再生的能力，而且中樞神經膠質存在很多阻礙神經軸突生長的抑制因子，迄今仍缺乏有效的治療手段。目前大量動物實驗研究表明，在適當的條件下，中樞神經纖維也可以再生，促進再生的方法包括應用神經營養因子〔2〕、雪旺氏細胞移植、外周神經移植、下調神經生長抑制因子等〔3〕。

近年的研究顯示，通過往眼內注入巨噬細胞激活劑酵母聚糖（zymosan，ZYM）來激活巨噬細胞同樣可以顯著地促進RGC的存活及神經軸突再生〔4〕，而應用巨噬細胞抑制因子（macrophage inhibitory factor，MIF）或巨噬細胞清除劑氯膦酸二鈉脂質體可以明顯降低其促進神經修復的作用〔5〕。然而，眼內注射ZYM除了可以趨化并激活來自外周血的巨噬細胞外，還有可能激活視網膜組織當中的巨噬細胞-小膠質細胞〔6〕，并產生相應的生物學作用，但這些作用是否有利于神經修復尚未被完全闡明。我們前期的研究工作表明，視神經損傷本身可以激活視網膜的小膠質細胞，使其轉變成巨噬細胞，以清除凋亡的RGC〔7〕。有研究顯示，巨噬細胞刺激因子（macrophage stimulating factor，MSF）及MIF可以直接影響巨噬細胞/小膠質細胞的活性，從而影響實驗性自身免疫性腦脊髓炎的轉歸〔8〕。本研究擬應用體外視網膜整體培養模型，研究MSF/MIF對巨噬細胞/小膠質細胞的作用，并觀察其對培養視網膜中神經軸突再生的直接影響。

1　材料和方法

1.1實驗材料

8～10周齡費希爾大鼠9只，體質量約200 g（北京維通利華公司）；生物安全柜（上海瑞仰凈化裝備公司）；手術顯微鏡（德國LEICA）；眼科手術器械（蘇州六六公司）；培養板（美國Corning）；二氧化碳培養箱（美國REVCO）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon）；圖像采集分析系統（美國Conpix）。神經細胞培養基Neurobasal-A、B27及谷氨酰胺（美國Invitrogen）；視網膜節細胞特異性抗體TUJ-1（美國COVANCE）；巨噬細胞特異性抗體ED-1（美國Serotec）；Cy3熒光染料（美國Jackson Lab）；MSF（美國Sigma-Aldrich）；MIF（美國Sigma-Aldrich）。

1.2實驗方法

1.2.1視神經損傷模型：研究發現，視神經損傷本身可以刺激培養中RGC神經軸突的再生，因此在視網膜整體培養之前7 d，我們對視神經進行損傷處理〔9〕。具體操作如下：腹腔注射1.5 ml/kg 1：1混合的鹽酸氯胺酮（100 mg/ml）及鹽酸賽拉嗪（20 mg/ml）麻醉大鼠。在左側眼球上方切開結膜切口長約5 mm，分離眼外肌及眶內結締組織暴露視神經。在距離眼球后端1.5 mm處用顯微眼科鑷夾緊視神經持續10 s，以達到完全離斷視神經而確保視神經外鞘膜完整性，操作中注意避免傷及行走在視神經下的血管〔5〕，損傷術后大鼠存活7 d。

1.2.2包被培養板：視網膜培養在24孔培養板中進行，培養板需進行預先包被，每孔加入0.25 ml多聚賴氨酸（200 μg/ml溶于超純水）在37℃，5%CO2培養箱中靜置過夜。超純水洗5 min×3次，加入層粘連蛋白[20 μg/ml溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）]置于37℃，5%CO2培養箱中2 h，進行視網膜培養前用PBS洗3次。

1.2.3視網膜分組培養：9只大鼠在視神經損傷術后7 d進行過量麻醉處死，無菌操作下取出眼球，置于冰冷的平衡鹽溶液中進行視網膜剝離，把剝離下來的視網膜平鋪，放射狀剪成8片，取其中的3片隨機分配至對照組、MSF及MIF處理組，即每組培養9個視網膜塊，每組里面的各個視網膜培養塊均取自不同個體大鼠左側眼球的視網膜。將每一片視網膜粘鋪于已包被好的培養板孔中，對照組加入0.5 ml培養基（Neurobasal-A+B27+谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素），MSF、MIF組除培養基外分別加入MSF（終濃度為1 μmol/L）及MIF（終濃度為5 μmol/L），均置于37℃，5%CO2培養箱中培養7 d〔5〕。

1.2.4免疫組織化染色觀察再生神經軸突及遷移巨噬細胞：培養7 d后，用4%多聚甲醛（上海生工公司）固定視網膜2 h，然后用PBS洗5 min×3次，加10%正常羊血清封閉液，濕盒內室溫封閉1 h，吸掉多余液體，加入視網膜節細胞特異性抗體TUJ-1或巨噬細胞特異性抗體ED-1，濕盒內常溫1 h，PBS洗5 min×3次，加入熒光二抗Cy3，濕盒內常溫1 h，PBS洗5 min×3次后在倒置熒光顯微鏡下觀察再生神經軸突或遷移的巨噬細胞，并對每個視網膜培養塊再生軸突的數量與長度及外遷巨噬細胞的數量分別進行統計。再生軸突的數量為從每個視網膜培養塊長出的所有神經軸突的數量；把每個視網膜培養塊再生最長的5根軸突長度的平均值記錄為再生軸突的長度〔5〕。

1.3統計學方法

應用GraphPad InStat（V2.04）統計軟件對所得數據進行分析。各組數值以均數±標準誤（）表示，組間總體差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法〔10-11〕。檢驗水準α=0.05。

2　結果

2.1MSF/MIF對巨噬細胞遷移的影響

往視網膜外遷移的巨噬細胞形態及數量分別為圖1A、1B、1C所示。巨噬細胞在視網膜培養第3～4天開始從視網膜塊里往外遷移，并日漸增加，培養7 d后，對照組平均每個視網膜培養塊往外遷移的巨噬細胞數量為306±34。當培養基中加入巨噬細胞激活劑MSF后，往外遷移的巨噬細胞平均數量約增多了30%（402±43），而應用巨噬細胞抑制劑MIF后，外遷的巨噬細胞數量則明顯下降了30%（208±35）。MSF或MIF處理后，雖然遷移的細胞平均數量有所改變，但由于變異性較大，與對照組相比差別并沒有統計學意義（P＞0.05）；然而MSF與MIF組間的差異則非常明顯（P＜0.01）（表1）。

2.2MSF/MIF對RGC神經軸突再生的影響

從視網膜培養塊長出的RGC神經軸突形態及數量分別為圖1D、1E、1F所示。在視網膜培養第2天開始即可見少量神經軸突從視網膜培養塊邊緣生長出來，并沿培養板表面向外延伸，神經突的數量及長度日漸增加。視網膜培養7 d后，對照組視網膜培養塊的平均再生神經軸突數量為23±2.8，長度為（1.31±0.12）mm。MSF在促進巨噬細胞遷移的同時也明顯促進神經軸突的再生，使其數量增加50%（36±3.3）（P＜0.05），但神經軸突的長度并未明顯受影響[（1.53±0.09）mm]。MIF則可以明顯抑制神經軸突的再生，與對照組比較，它既可以減少再生神經軸突的數量（12±2.7）（P＜0.05），同時也使再生神經軸突的長度降低了40%[（0.82±0.11）mm）]（P＜0.05）（表1）。

表1　各組大鼠視網膜培養7 d后巨噬細胞遷移及神經節細胞再生指標比較（）

表1　各組大鼠視網膜培養7 d后巨噬細胞遷移及神經節細胞再生指標比較（）

注：單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni法。與對照組比較，①P＜0.05；與MSF組比較，②P＜0.01，③P＜0.001 MSF：巨噬細胞刺激因子MIF：巨噬細胞抑制因子

再生軸突長度（m m）對照組9 3 0 6 ± 3 4 2 3 ± 2 . 8 1 . 3 1 ± 0 . 1 2 M S F組9 4 0 2 ± 4 3 3 6 ± 3 . 3①1 . 5 3 ± 0 . 0 9 M I F組9 2 0 8 ± 3 5②1 2 ± 2 . 7①③0 . 8 2 ± 0 . 1 1①③F值6 . 6 7 1 6 . 6 4 1 1 . 4 5 P值0 . 0 0 5 0 . 0 0 0 1 0 . 0 0 0 3組別培養塊個數巨噬細胞數量再生軸突數量

圖1　各組大鼠視網膜培養7 d后倒置熒光顯微鏡像（Cy3×200）。顯示視網膜培養中外遷的巨噬細胞及再生的神經軸突纖維。對照組可見巨噬細胞（A）及神經軸突（D）從視網膜培養塊（*）邊緣外遷及生長出來，并向外延伸；MSF組可見外遷巨噬細胞（B）及再生神經軸突（E）明顯增多；MIF組可見外遷巨噬細胞（C）及再生神經軸突（F）顯著減少MSF：巨噬細胞刺激因子MIF：巨噬細胞抑制因子

3　討論

我們先前的研究發現睫狀神經營養因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）除了能夠促進RGC的存活及軸突再生〔11〕，也可以導致眼內巨噬細胞的增加，并證明趨化到眼內的巨噬細胞也參與CNTF的促神經修復作用〔5〕，其它研究也證實眼內巨噬細胞的直接激活可以有效地促進RGC存活及神經軸突再生〔4〕。被激活的巨噬細胞既可以分泌多種促神經修復的因子，其中包括主要促進神經元存活的因子如腦源性神經營養因子〔12〕，也包括主要促進神經軸突再生的因子，如癌調蛋白〔13〕?？梢?，巨噬細胞激活具有促進神經損傷后修復的作用。一般認為，眼內被激活的巨噬細胞是來自外周血液循環的單核巨噬細胞系統〔12〕，但有研究者認為視網膜內處于靜息狀態的巨噬細胞-小膠質細胞也可以被激活為具有吞噬功能及分泌功能的活性巨噬細胞〔14〕，這些細胞被激活后也可以分泌各種細胞因子及神經營養因子〔15-16〕，但神經組織來源的巨噬細胞是否具有促進神經損傷后修復的作用并沒有被研究清楚。本研究通過應用MSF及MIF對體外培養的視網膜組織直接作用來研究其對視網膜組織自身的巨噬細胞及RGC神經軸突的再生的影響。MSF又稱Tuftsin〔17〕，結構為蘇氨酸-賴氨酸-脯氨酸-精氨酸，能夠激活巨噬細胞并增強其自然殺傷及抗腫瘤的作用〔18〕；巨噬細胞抑制因子MIF在結構上比MSF少一個氨基酸，結構為蘇氨酸-賴氨酸-脯氨酸，常用于抑制巨噬細胞的活性〔19〕。在體外視網膜培養模型中，由于缺乏外周血循環來源的巨噬細胞，我們可以觀察到MSF及MIF對視網膜來源的巨噬細胞的直接作用，結果顯示向培養塊外遷移的巨噬細胞會分別相應地增多及減少；與此同時，MIF還可以減少RGC再生神經突的數量及長度，MSF雖未能增加神經突的長度，但還是有效地增加了再生神經突的數量。由此可見，視網膜來源的巨噬細胞被MSF激活后，很可能產生一些有利于神經軸突再生的因子，但是否會像血液源性的巨噬細胞一樣，產生可以強烈促進軸突再生的癌調蛋白仍需進一步研究。

[1]Mey J，Thanos S.Intravitreal injections of neurotrophic factors support the survival of axotomized retinal ganglion cells in adult rats in vivo[J].Brain Res，1993，602（2）：304-317.

[2]Cui Q，Lu Q，So KF，et al.CNTF，not other trophic factors，promotes axonal regeneration of axotomized retinal ganglion cells in adult hamsters[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40（3）：760-766.

[3]Chen MS，Huber AB，van der Haar ME，et al.Nogo-A is a myelinassociated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1[J].Nature，2000，403（6768）：434-439.

[4]Yin Y，Cui Q，Li Y，et al.Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration[J].J Neurosci，2003，23（6）：2284-2293.

[5]Cen LP，Luo JM，Zhang CW，et al.Chemotactic effect of ciliary neurotrophic factor on macrophages in retinal ganglion cell survival and axonal regeneration[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48（9）：4257-4266.

[6]Baldwin KT，Carbajal KS，Segal BM，et al.Neuroinflammation triggered by beta-glucan/dectin-1 signaling enables CNS axon regeneration[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（8）：2581-2586.

[7]Cen LP，Han M，Zhou L，et al.Bilateral retinal microglial response to unilateral optic nerve transection in rats[J].Neuroscience，2015，311：56-66.

[8]Bhasin M，Wu M，Tsirka SE.Modulation of microglial/macrophage activation by macrophage inhibitory factor（TKP）or tuftsin（TKPR）attenuates the disease course of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].BMC Immunol，2007，8：10.

[9]Fischer D，Petkova V，Thanos S，et al.Switching mature retinal ganglion cells to a robust growth state in vivo：gene expression and synergy with Rho A inactivation[J].J Neurosci，2004，24（40）：8726-8740.

[10]Luo JM，Cen LP，Zhang XM，et al.PI3K/akt，JAK/STAT and MEK/ ERK pathway inhibition protects retinal ganglion cells via different mechanisms after optic nerve injury[J].Eur J Neurosci，2007，26（4）：828-842.

[11]Park K，Luo JM，Hisheh S，et al.Cellular mechanisms associated with spontaneous and ciliary neurotrophic factor-cAMP-induced survival and axonal regeneration of adult retinal ganglion cells[J].J Neurosci，2004，24（48）：10806-10815.

[12]Cui Q，Yin Y，Benowitz LI.The role of macrophages in optic nerve regeneration[J].Neuroscience，2009，158（3）：1039-1048.

[13]Yin Y，Henzl MT，Lorber B，et al.Oncomodulin is a macrophagederived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells[J].Nat Neurosci，2006，9（6）：843-852.

[14]Garcia-Valenzuela E，Sharma SC，Pina AL.Multilayered retinal microglial response to optic nerve transection in rats[J].Mol Vis，2005，11：225-231.

[15]Hanisch UK.Microglia as a source and target of cytokines[J].Glia，2002，40（2）：140-155.

[16]Hailer NP.Immunosuppression after traumatic or ischemic CNS damage：it is neuroprotective and illuminates the role of microglial cells[J].Prog Neurobiol，2008，84（3）：211-233.

[17]Khare S，Bhutani LK，Rao DN.Quantitative assessment of tuftsin receptor expression and second messenger during in vitro differentiation of peripheral blood derived monocytes of leprosy patients[J].Mol Cell Biochem，1997，171（1-2）：1-10.

[18]Gupta CM，Haq W.Tuftsin-bearing liposomes as antibiotic carriers in treatment of macrophage infections[J].Methods Enzymol，2005，391：291-304.

[19]Emmetsberger J，Tsirka SE.Microglial inhibitory factor（MIF/TKP）mitigates secondary damage following spinal cord injury[J].Neurobiol Dis，2012，47（3）：295-309.

Effects of macrophage stimulating factor and macrophage inhibitory factor on retinal ganglion cell ax-on regeneration in retinal explant

CEN Lingping，LIANG Jiajian，ZHANG Mingzhi.
Joint Shantou International Eye Center of Shantou University and The Chinese University of Hong Kong，Shantou 515041，Guangdong，China

OBJECTIVE To investigate the effects of macrophage stimulating factor（MSF）and macrophage inhibitory factor（MIF）on retinal ganglion cells（RGC）axon regeneration in retinal explant.METHODS It was an experimental study.Seven days after optic nerve（ON）transection of Fischer rat，retinas were extracted out and flat-mounted onto a filter paper.After being cut into 8 pieces，each piece of retina was glued to the substrate of culture plate and incubated in culture medium with MSF or MIF interventions respectively.Retinal explants were fixed after cultured for seven days.After fluorescent immunostaining，migrating out macrophages and regenerating axon were counted under the fluorescent microscope.Main outcome were number of migrating out macrophage，number and length of regenerating axons.RESULTS Compared with the control group，MSF and MIF could increase or decrease the number of migrating out macrophages respectively.Meanwhile，MIF could increase the number of regenerating axons and their length.However，MSF could only increase the number of regenerating axons，but had no effect on axon length.CONCLUSIONS The MSF could promote axon regeneration in retinal explant，while MIF could inhibit axon regeneration.

retinal ganglion cell;macrophage;injury of optic nerve;subsist;axon regeneration

R774

A

1002-4379（2016）03-0150-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.03.003

國家自然科學研究基金（81570849）；高等學校博士學科點專項科研基金（20114402120007）；廣東省自然科學基金（2015A030313446）

汕頭大學·香港中文大學聯合汕頭國際眼科中心，廣東汕頭515041

岑令平，E-mail：cenlp@hotmail.com