基因沉默整合素連接酶對胰腺癌細胞上皮向間質轉化的影響

魏洪吉

【摘要】 目的 探討基因沉默整合素連接酶（ILK）對胰腺癌細胞（Panc-1）上皮向間質轉化（EMT）的影響。方法 培養Panc-1細胞， 構建ILK-specific-shRNA慢病毒載體后， 再行轉染Panc-1細胞， 通過Western-blot技術驗證感染基因的有效性， 同時比較Panc-1細胞上皮向EMT轉化標志性蛋白E-鈣連蛋白（E-cadherin）表達情況。結果 ①基因沉默ILK明顯的抑制了Panc-1細胞的遷移、侵襲能力， 且陽性組細胞遷移率和侵襲率均為（0.15±0.03）， 明顯低于陰性組（0.43±0.02）， 差異具有統計學意義（t=23.572， P<0.01）。②SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電脈法（SDS-PAGE）結果：E-cadherin的條帶為122～141 KD， GAPDH為37 KD的條帶。siRNA慢病毒轉染Panc-1細胞后KD組E-cadherin表達為（0.545±0.011）， 明顯高于陰性組（0.079±0.004）， 差異有統計學意義（t=28.942， P<0.01）。結論 基因沉默ILK轉染后， 明顯抑制Panc-1細胞遷移、侵襲能力， 顯著上調E-cadherin 表達， 逆轉了EMT 的發生。

【關鍵詞】 基因沉默；整合素連接酶；胰腺癌細胞；上皮向間質轉化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.27.194

胰腺癌發病率占常見惡性腫瘤的1%～2%， 死亡率高[1]。由于多數患者在確診時己發生癌細胞轉移， 無法進行胰腺切除手術， 只能采用化療、放療等姑息治療手段， 隨之產生的副作用嚴重降低了患者的生活質量。尋找新的治療思路迫在眉睫。ILK是一種細胞內信號蛋白， 是多種致瘤相關因素的上游交叉點， 與腫瘤的形成、增殖、凋亡、轉化和侵襲轉移密切相關[2]。因此， 研究ILK對胰腺癌細胞EMT的影響可能是一種新的治療思路。

1 材料與方法

1. 1 材料 人胰腺癌Panc-1細胞株購自中國科學院細胞庫；兔E-cadherin抗體、ILK多克隆抗體、BCA蛋白定量試劑盒、增強化學發光試劑、PVDF膜等購自武漢博士德生物工程有限公司；低溫高速離心機購自德國Heraeus公司產品；轉膜電泳槽購自美國 Bio-Rad 公司；PCR儀（PE2400）購自美國Perking Elmer公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 ILK-specific shRNA 慢病毒載體的構建 針對目的基因序列， 采用siSearch和sFold兩種在線設計軟件設計核苷酸序列[3]。將自行合成的含干擾序列的雙鏈DNAoligo兩端含酶切位點的粘端連入酶切后的RNA干擾載體上， 再轉入制備好的細菌感受態細胞， 對長出的克隆先進行聚合酶鏈式反應（PCR）鑒定， 測序比對， 鑒定陽性即構建成功。

1. 2. 2 感受態細胞的制備轉染 人胰腺癌Panc-1細胞株常規接種于高糖杜爾伯科改良伊格爾培養基（DMEM）培養液中[4]（含10%胎牛血清、10 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）， 于5%二氧化碳飽和濕度、37℃條件下培養， 每2天換液1次。將一個上述培養基中的單菌落轉到SOB培養基中， 37℃劇烈振搖3 h， 然后轉移到無菌預冷的丙烯管中， 冷卻至0℃， 以4000 r/min離心10 min回收細胞。以0.1 mol/L CaCl2重懸， 4℃下， 4000 r/min離心10 min回收細胞， 連接反應制備克隆連接液， 轉化。正常目的細胞在6孔板上分為三組：①空白組：未感染任何病毒；②陰性組：加陰性對照病毒感染；③陽性組：加RNAi靶點病毒感染。感染4 d后行PCR檢測。

1. 2. 3 Western blot 檢測 提取目的細胞中的蛋白， 蛋白定量法（BCA法）對蛋白進行定量測定。再取適量蛋白樣品， 95℃加熱變性， 以SDS-PAGE分離， 每孔上樣量為100 μg。常規處理后轉至PVDF膜， 5%脫脂牛奶封閉40 min， 倒掉封閉液， 加一抗4℃孵育過夜， TBST洗膜3次， 分別加入相應的二抗孵育1 h后TBST洗膜3次， 最后化學發光法顯影， 暗室曝光， 使用凝膠掃描儀掃描分析， 以Quantity One軟件對條帶進行分析。

1. 2. 4 細胞遷移與侵襲實驗 細胞侵襲實驗操作如下：鑷子經乙醇消毒后， 置于培養箱中達到室溫， 然后以其處理侵襲室內的嵌入物， 加入300 μl無血清培養基。各組細胞以無血清培養基重懸， 以血球計數板計數， 調整細胞密度約為5×108個。取200 μl細胞懸液加入侵襲室上室嵌入物， 下室加入500 μl 胎牛血清（FBS）高于侵襲室的培養基， 于組織培養箱中培養2～3 d。去除培養基， 以棉拭子拭去非侵襲細胞， 于每孔嵌入物中加入500 μl染色液染色， 浸泡20 min， 再反復沖洗， 空氣中晾干， 以10%醋酸溶解， A570檢測。細胞遷移實驗步驟同侵襲實驗， 但下室所加FBS濃度為30%。

1. 3 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 siRNA慢病毒轉染對Panc-1遷移和侵襲的影響 基因沉默ILK明顯的抑制了Panc-1細胞的遷移、侵襲能力， 且陽性組細胞遷移率和侵襲率均為（0.15±0.03）， 明顯低于陰性組（0.43±0.02）， 差異具有統計學意義（t=23.572， P<0.01）。

2. 2 siRNA 慢病毒轉染 Panc-1 細胞后E-cadherin 表達情況 SDS-PAGE結果：E-cadherin的條帶為122～141 KD， GAPDH為37 KD的條帶。siRNA慢病毒轉染Panc-1細胞后KD組E-cadherin表達為（0.545±0.011）， 明顯高于陰性組（0.079±0.004）， 差異有統計學意義（t=28.942， P<0.01）。

3 討論

胰腺癌是預后較差的惡性腫瘤之一， 由于胰腺癌早期診斷困難， 且易發生血液或淋巴轉移， 一般確診后生存期平均≤6個月， 5年內生存率<5%[5]， 給社會和患者家庭造成極大負擔。癌細胞侵襲和轉移是目前臨床研究的熱點。ILK作為整合素和生長因子受體信號轉導途徑中的一個重要效應物， 調節著細胞的豁附、生存、分化和凋亡， 對腫瘤的發展、轉移及預后等發揮著重要作用[6]。莊翔等[7]研究顯示， ILK在人類神經源性腫瘤、胃癌、卵巢腫瘤、黑色素瘤、肺癌中ILK表達明顯增高。上皮向間質轉化是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。正常情況下EMT的發生受到嚴密調控， 但腫瘤發展過程中， EMT是腫瘤細胞獲得侵襲和轉移能力的重要途徑。ILK作為EMT的誘導因子， 在腫瘤侵襲轉移過程中有與癌基因類似的效應， 因此有效的抑制ILK的表達或降低其生物學活性是抗腫瘤治療的關鍵。E-cadherin為EMT的標志性蛋白， ILK的過度表達則會導致E-cadherin的減少或缺失， 檢測E-cadherin 蛋白表達情況可反映ILK對EMT的影響。

研究顯示， 基因沉默ILK明顯的抑制了Panc-1細胞的遷移、侵襲能力， 且陽性組細胞遷移率和侵襲率均為（0.15±0.03）， 明顯低于陰性組（0.43±0.02）， 差異具有統計學意義（t=23.572， P<0.01）。同時， SDS-PAGE結果顯示：E-cadherin的條帶為122～141 KD， GAPDH為37 KD的條帶。siRNA慢病毒轉染Panc-1細胞后KD組E-cadherin表達為（0.545±0.011）， 明顯高于陰性組（0.079±0.004）（t=28.942， P<0.01）。表明ILK可通過抑制Panc-1細胞遷移、侵襲能力、上調E-cadherin 表達抑制EMT發生， 可作為胰腺癌臨床治療的重要思路。

綜上所述， 基因沉默ILK可明顯抑制Panc-1細胞遷移、侵襲能力， 上調E-cadherin 表達， 逆轉EMT 的發生。

參考文獻

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[2] 李曉紅， 陸晶晶， 朱慧， 等. 抑制微小RNA-200a表達對胰腺癌上皮-間充質轉化過程的影響. 中華實驗外科雜志， 2014， 31（10）：2178-2181.

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[4] Bradford JW， Baldwin AS. Chapter Three-IKK/Nuclear Factor-kappaB and Oncogenesis： Roles in Tumor-Initiating Cells and in the Tumor Microenvironment. Advances in Cancer Research， 2014， 121（121）：125-145.

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[6] 黃懿， 韶云鵬， 丁留成， 等. 過表達整合素連接酶基因腺病毒體外轉染骨髓間充質干細胞的研究. 中華實驗外科雜志， 2014， 31（6）：1373.

[7] 莊翔， 朱軍， 呂夢欣， 等. 特異性ILK siRNA對膀胱癌EJ細胞EMT及移植瘤生長的影響. 基礎醫學與臨床， 2016， 36（2）：191-198.

[收稿日期：2016-07-26]