丹黃通脈方對大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響

齊 婧，王永剛，鄭 剛，陳敏娜，羅 瑜，鐘 偉，尚俊平

(1． 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046;2． 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000;3． 陜西省榆林市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 榆林 719000)

?

論 著

丹黃通脈方對大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響

齊 婧1,2，王永剛1,2，鄭 剛1,2，陳敏娜1,2，羅 瑜3，鐘 偉1,2，尚俊平1,2

(1． 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046;2． 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000;3． 陜西省榆林市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 榆林 719000)

目的 觀察丹黃通脈方對頸動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠斑塊穩(wěn)定性的影響。方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、丹黃通脈方組，每組10只。空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組、丹黃通脈方組給予高脂復(fù)合飼料喂養(yǎng)，持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)。除空白組外，其余2組在飼養(yǎng)1周后給予腹腔注射維生素D3制作模型。于第8周開始，丹黃通脈方組給予丹黃通脈方[10 mL/(kg·d)]灌胃，空白組及模型組給予等量蒸餾水灌胃，每天灌胃2次，連續(xù)6周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察各組頸動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化，測定內(nèi)膜/中膜面積比及巨噬細(xì)胞陽性率。結(jié)果 光鏡下觀察結(jié)果顯示，模型組血管內(nèi)膜明顯增厚，泡沫樣細(xì)胞堆積，彈力纖維層不同程度破壞、斷裂；丹黃通脈方組血管內(nèi)膜稍增厚，可見少量泡沫樣細(xì)胞形成，彈力纖維層稍紊亂，程度較模型組輕。丹黃通脈方組大鼠內(nèi)膜/中膜面積比及巨噬細(xì)胞陽性率均明顯低于模型組(P均<0.05)。結(jié)論 丹黃通脈方能夠減少巨噬細(xì)胞在血管內(nèi)膜的浸潤，抑制血管內(nèi)膜的增生，達(dá)到調(diào)控頸動(dòng)脈粥樣硬化形成和穩(wěn)定斑塊的作用。

丹黃通脈方；頸動(dòng)脈粥樣硬化；組織形態(tài)學(xué)；內(nèi)膜/中膜面積比；巨噬細(xì)胞

動(dòng)脈粥樣硬化常可累及多處血管，如頸動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈、主動(dòng)脈、腎動(dòng)脈等，是心腦血管疾病產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)，有20%～35%的頸動(dòng)脈粥樣硬化可導(dǎo)致缺血性腦中風(fēng)的發(fā)生，頸動(dòng)脈粥樣硬化已嚴(yán)重危害人類的生命與健康；且頸動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊脫落可導(dǎo)致患者快速致殘致死，風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于引起的頸動(dòng)脈狹窄[1]。研究表明，斑塊局部的巨噬細(xì)胞聚集促進(jìn)了病變部位的炎性反應(yīng)，增加斑塊破裂和血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[2]。筆者前期研究表明丹黃通脈方防治頸動(dòng)脈粥樣硬化臨床療效確切[3]。本研究通過建立頸動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型，觀察丹黃通脈方對頸動(dòng)脈內(nèi)膜增殖及粥樣硬化中巨噬細(xì)胞的影響，以期進(jìn)一步明確丹黃通脈方調(diào)控頸動(dòng)脈粥樣硬化形成和穩(wěn)定斑塊的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(120±10)g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(軍)2015-0014。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周(普通飼料，自由飲水)，保持室溫20～25 ℃。

1.2 藥品與試劑 維生素D3注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：121125)；丙基硫氧嘧啶(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：120501)；高脂復(fù)合飼料配方：76.5%基礎(chǔ)飼料、10%蛋黃粉、8%豬油、4.8%食鹽、0.5%膽鹽、0.2%丙硫氧嘧啶(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.3 丹黃通脈方制備 丹黃通脈方由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科制備。丹參、黃連、葛根、三七配比為2∶2∶1∶0.5，常規(guī)水煎煮，制備成含生藥量1 g/mL的藥液，備用。

1.4 分組及給藥 將上述30只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周大鼠編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、模型組、丹黃通脈方組，每組10只。空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組、丹黃通脈方組給予高脂復(fù)合飼料喂養(yǎng)，持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)。除空白組外，其余2組參照文獻(xiàn)[4]方法制作頸動(dòng)脈粥樣硬化模型，即在高脂復(fù)合飼料喂養(yǎng)當(dāng)天給予腹腔注射維生素D360萬IU/kg ，隨后于第3，6，7周首日分別給予維生素D3腹腔注射10萬IU/kg ，自由飲水。于第7周末，模型組、丹黃通脈方組各處死1只大鼠，取頸動(dòng)脈行HE染色，鏡下見內(nèi)膜明顯增厚，提示造模成功。于第8周開始，丹黃通脈方組給予丹黃通脈方[10 mL/(kg·g)]灌胃，空白組及模型組給予等量蒸餾水灌胃，每天灌胃2次，連續(xù)6周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及內(nèi)膜/中膜面積比 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別處死各組大鼠，立即取頸動(dòng)脈置于4%多聚甲醛中固定24 h。經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋，備用。標(biāo)本5 μm厚度連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察。利用Quantiment520型計(jì)算機(jī)圖像分析儀分別測量血管內(nèi)膜和中膜橫斷面的面積，并計(jì)算內(nèi)膜/中膜面積比。

1.5.2 巨噬細(xì)胞陽性率 標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟入水后，利用Envision法進(jìn)行頸動(dòng)脈巨噬細(xì)胞免疫組化染色，棕黃色染色為巨噬細(xì)胞陽性細(xì)胞，對每個(gè)樣本中黃染最明顯的部位進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)表現(xiàn) 空白組血管內(nèi)膜無增厚，內(nèi)皮細(xì)胞緊貼彈力纖維層，彈力纖維層完整，中膜平滑肌細(xì)胞核呈梭形，見圖1。模型組血管內(nèi)膜明顯增厚，泡沫樣細(xì)胞堆積，彈力纖維層不同程度破壞、斷裂，見圖2。丹黃通脈方組血管內(nèi)膜稍增厚，可見少量泡沫樣細(xì)胞形成，彈力纖維層稍紊亂，程度較模型組輕，見圖3。

圖1 空白組頸動(dòng)脈HE染色表現(xiàn)(×200)

圖2 模型組頸動(dòng)脈HE染色表現(xiàn)(×200)

圖3 丹黃通脈方組頸動(dòng)脈HE染色表現(xiàn)(×200)

2.2 頸動(dòng)脈內(nèi)膜/中膜面積比 空白組內(nèi)膜/中膜面積比為0，模型組為1.73±0.21，丹黃通脈方組為0.68±0.11。丹黃通脈方組內(nèi)膜/中膜面積比明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3 巨噬細(xì)胞陽性率 空白組頸動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜未見棕黃色的巨噬細(xì)胞，模型組及丹黃通脈方組血管內(nèi)膜及中膜可見大量的陽性細(xì)胞。空白組巨噬細(xì)胞陽性率為0，模型組巨噬細(xì)胞陽性率為(67.39±2.53)%，丹黃通脈方組巨噬細(xì)胞陽性率為(32.12±3.29)%，丹黃通脈方組巨噬細(xì)胞陽性率明顯低于模型組(P<0.05)。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis ，AS)不僅是脂質(zhì)的紊亂，同時(shí)也是一種慢性炎癥性疾病[4]。在AS形成的最早期，由于機(jī)體攝取了大量的膽固醇引起血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，使循環(huán)血液中單核細(xì)胞受局部產(chǎn)生的化學(xué)趨附分子的吸引，遷移到血管內(nèi)膜下，進(jìn)而分化成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬被氧化修飾的低密度脂蛋白轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，大量泡沫細(xì)胞聚集就形成了脂紋，進(jìn)而引起內(nèi)膜增厚[5]。因此，單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的聚集和增殖在AS發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，貫穿于整個(gè)疾病過程，已成為干預(yù)AS形成的重要作用途徑和靶點(diǎn)[6]。研究表明，易損斑塊與巨噬細(xì)胞有著非常密切的關(guān)系：一是巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)和趨化因子誘導(dǎo)MMPs表達(dá)，可降解和削弱帽狀腱膜基質(zhì)，導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定[7-9]；二是在多種趨化因子的作用下，使斑塊局部的巨噬細(xì)胞聚集，促進(jìn)了病變部位的炎性反應(yīng)，增加斑塊破裂和血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[10]；三是活化巨噬細(xì)胞和趨化因子刺激多種生長因子如VEGF和PDGF的表達(dá)上調(diào)，使血管外膜的滋養(yǎng)管侵入內(nèi)膜，導(dǎo)致內(nèi)膜血管新生，使易損斑塊的穩(wěn)定性進(jìn)一步降低[11-12]。

頸動(dòng)脈粥樣硬化屬中醫(yī)學(xué)中本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證，痰濁、瘀血、毒邪貫穿于該病的始末。頸動(dòng)脈粥樣硬化病位在血脈，痰濁停聚日久，阻礙經(jīng)絡(luò)、氣血運(yùn)行，血行滯澀，日久“毒”損脈絡(luò)，進(jìn)而阻痹脈管，形成粥樣硬化斑塊。近年來，中醫(yī)藥在動(dòng)脈粥樣硬化的防治領(lǐng)域取得了較大的進(jìn)展[13-14]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中藥能夠一定程度減少粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞數(shù)目，從而干預(yù)頸動(dòng)脈粥樣硬化的形成[15]。

丹黃通脈方由丹參、黃連、葛根、三七組成，具有活血解毒、消斑通脈的功效，能夠降低頸動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠血清Hcy、CRP、TNF-α、ICAM-1及LDL-C水平，具有調(diào)節(jié)血脂代謝和抗炎作用[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組內(nèi)膜明顯增厚，可見泡沫細(xì)胞堆積，丹黃通脈方組內(nèi)膜增殖受到抑制，可見少量泡沫細(xì)胞，且內(nèi)膜/中膜面積比明顯低于模型組；模型組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜可見大量的巨噬細(xì)胞，丹黃通脈方干預(yù)后，巨噬細(xì)胞陽性表達(dá)率明顯低于模型組。表明丹黃通脈方能夠抑制血管內(nèi)膜的增生，減少泡沫細(xì)胞數(shù)量及巨噬細(xì)胞在血管內(nèi)膜的浸潤，達(dá)到調(diào)控頸動(dòng)脈粥樣硬化形成和穩(wěn)定斑塊的作用。

[1] Daskalopoulou SS,Daskalopoulos ME,Perrea D,et al. Carotid artery atherosclerosis:what is the evidence for drug action?[J]. Curr Pharm Des，2007，13(11):1141-1159

[2] Nakagawa K,Chen YX,Ishibashi H,et al. Angiogenesis and its regulation:roles of vascular endothelial cell growth factor[J]. Semin Thromb Hemost，2000，26(1):61-66

[3] 王永剛,齊婧,鄭剛,等. 丹黃通脈膠囊治療頸動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄的臨床研究[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2012,10(4):445-447

[4] Hansson GK,Libby P. The immune response in atherosclerosis:a double-edged sword[J]. Nat RevImmunol，2006，6(7):508-519

[5] Mangge H,Hubmann H,Pilz S,et al. Beyond cholesterolinflammatory cytokines, the key mediators in atherosclerosis[J]. Clin Chem Lab Med，2004，42(5):467-474

[6] Choudhury RP,Lee JM,Greaves DR. Mechanisms of disease:macrophage-derived foam cells emerging as therapeutic targets in atherosclerosis[J]. Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2005，2(6):309-315

[7] Gerszten RE,Mach F,Sauty A,et al. Chemokines,leukocytes,and atherosclerosis[J]. J Lab Clin Med，2000，136(2):87-92

[8] Heo SH,Cho CH,Kim HO,et al. Plaque rupture is a determinant of vascular events in carotid artery atherosclerotic disease:involvement of matrix metalloproteinases 2 and 9[J]. J Clin Neurol，2011，7(2):69-76

[9] Galis ZS,Khatri JJ. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis:the good,the bad,and the ugly[J]. Circ Res，2002，90(3):251-262

[10] Newby AC. Matrix metalloproteinases regulate migration,proliferation,and death of vascular smooth muscle cells by degrading matrix and non-matrix substrates[J]. Cardiovasc Res，2006，69(3):614-624

[11] Pelisek J,Well G,Reeps C,et al. Neovascularization and angiogenic factors in advanced human carotid artery stenosis[J]. Circ J，2012，76(5):1274-1282

[12] 齊婧,王永剛,鄭剛. 頸動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄中醫(yī)證候調(diào)查分析[J]. 陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,34(6):6-8

[13] 陳文強(qiáng),黃小波,王寧群,等. 陳皮半夏對頸動(dòng)脈硬化家兔血管細(xì)胞黏附分子-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)的影響[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志,2013,20(11):34-36

[14] 霍煜,梁卓,韓雅玲,等. 冠心舒通膠囊對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)MMP-9和TIMP-1表達(dá)的影響[J]. 中國動(dòng)脈硬化雜志,2014,22(5):463-466

[15] 何國厚,艾志兵,劉勇,等. 小檗堿對兔頸動(dòng)脈粥樣硬化中內(nèi)膜增生和巨噬細(xì)胞趨化作用的影響[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2006,23(1):94-96

[16] 王永剛,齊婧,鄭剛,等. 丹黃通脈方對頸動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄模型大鼠腦血流量的影響[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012，18(10):16-18

[17] 王永剛,齊婧,車紅磊,等. 丹黃通脈方對大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄模型炎性反應(yīng)的影響[J]. 陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,35(5):62-65

Effects of Dan Huang Tong Mai decoction on stability of plaques of carotid atherosclerosis in rats

QI Jing1,2, WANG Yonggang1,2, ZHENG Gang1,2, CHEN Minna1,2, LUO Yu3,ZHONG Wei1,2, SHANG Junping1,2

(1. Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shaanxi, China;2. The Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712000, Shaanxi,China；3. Yulin Hospital of Traditional Chinese Medicine,Yulin 719000, Shaanxi, China)

Objective It is to observe the effects of Dan Huang Tong Mai (DHTM) Decoction on stability of plaque of carotid atherosclerosis (AS)rats. Methods Thirty SD rats were randomly divided into blank group, model group and DHTM group, each group had 10 rats. The model group and DHTM group were established AS model through high-fat diet combined with intraperitoneal injection of vitamin D3, for 7 weeks to induce AS. The medication was carried out from the 8th week of the experiment and lasted for 6 weeks. At the end of the experiment,the pathological morphology of carotid artery, I/M and the ratio of macrophage were observed. Results Light microscope showed that the foam cells and endometrial were increased obviously, elastic fiber layer was damaged more or less in the model group compared with the blank control group, and the pathological changes were improved in the DHTM group. Compared with model group, I/M and the positive ratio of macrophage were lower in DHTM group(P<0.05). Conclusion Dan Huang Tong Mai Decoction may control carotid atherosclerosis progression, stabilizing vulnerable plaque, which may be associated with decrease the ratio of macrophage in intima and inhibit angiogenesis.

Dan Huang Tong Mai Decoction；carotid atherosclerosis；histomorphology；I/M；macrophage cell

齊婧，女，主治醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管病的臨床和基礎(chǔ)研究。

鄭剛，E-mail:zhenggang2283@163.com

陜西省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(14JK1192)；陜西省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研專項(xiàng)項(xiàng)目(13-JC001)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2013KTCQ03-05)；陜西省科技廳項(xiàng)目(2015JM8384)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.31.001

R-332

A

1008-8849(2016)31-3421-03

2016-05-05