紫芝擔孢子交配型的鑒定*

柯斌榕，盧政輝，吳小平，郭麗羨，蘭清秀

（1.福建省農業科學院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福建福州3500014；2.福建農林大學菌物研究中心，福建福州350002）

紫芝擔孢子交配型的鑒定*

柯斌榕1，盧政輝1，吳小平2**，郭麗羨2，蘭清秀1

（1.福建省農業科學院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福建福州3500014；2.福建農林大學菌物研究中心，福建福州350002）

以紫芝（Ganoderma sinense）的擔孢子萌發獲得的單核菌株為試驗材料，采用三輪雜交法、OWE-SOJ技術及核遷移技術對其擔孢子單核體交配型因子進行準確測定。結果表明，紫芝為四級性異宗結合菌類，其原生質體單核化菌株交配型分離比例符合1:1的預期，不同交配型擔孢子的單核體符合1:1:1:1的自由分離規律，采用OWE-SOJ與核遷移試驗相互印證，可以對紫芝擔孢子交配型進行準確測定。

紫芝；交配型；四級性；核遷移；OWE-SOJ

紫芝（Ganoderma sinense J.D.Zhao,L.W.Hsu& X.Q.Zhang）又名黑芝、中國靈芝，是中國特有的一個靈芝種類，并由我國靈芝分類專家趙繼鼎先生首次命名[1-2]。作為傳統的藥用靈芝品種，與赤芝和松杉靈芝一起收錄入《中國藥典》中并得到廣泛使用[3]。紫芝味甘、性溫，較赤芝而言苦味較輕，含有多種活性成分，如多糖、靈芝酸、生物堿等，具有安神、消炎、利尿等功效。

目前紫芝研究主要側重于功效成分和藥理研究，而在遺傳育種研究方面則鮮有報道。栽培的紫芝菌種也主要以野生分離馴化為主，目前審定的唯一一個紫芝品種“武芝2號”也是通過野生馴化而得到的[4]。劉新銳等[5]通過原生質體單核化技術測定了紫芝的不親和性因子，表明紫芝具有豐富的不親和性因子，但未就擔孢子單核體的交配因子進行分析。由于擔孢子是減數分裂的產物，含有豐富的遺傳變異因子。對紫芝擔孢子單核體交配型進行研究，不僅有助于了解紫芝的生活史，也為新品種改良和雜交育種提供實驗材料。本文通過對紫芝擔孢子單核體進行紫芝交配型因子的研究，擬為將來利用擔孢子單核體的遺傳多樣性進行雜交育種打下基礎。

1　材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株紫芝由福建農林大學菌物研究中心提供。

1.2培養基

PDA：土豆200 g，1 000 g水煮沸后過濾，2%瓊脂條煮沸后加入葡萄糖20 g，攪拌均勻，然后制備試管斜面。

OWE培養基：5%雜木屑浸汁200 mL，瓊脂20 g，加蒸餾水補至1 000 mL。5%雜木屑浸汁制備，取50 g雜木屑于1 L水中煮60 min，過濾去雜質加蒸餾水補足1 L。

SOJ培養基：鮮榨橘汁200 mL，121℃高壓滅菌30 min，使用時取20 mL，加入180 mL融化的水瓊脂中倒平板備用。

1.3擔孢子收集及單核體分離

選取新鮮剛開始彈射的紫芝子實體，采取活體套袋收集擔孢子的方法進行收集。將當天收集的擔孢子，常規稀釋至100倍，在顯微鏡視野中有10個～20個孢子即可，并涂布到PDA培養基中，25℃條件下培養，隨時觀察擔孢子萌發情況[6]。當有擔孢子萌發，即可按謝寶貴[7]的方法挑取，并鏡檢獲取孢子單核體。

1.4標準測交菌株制備

標準菌株采用原生質體單核化制備，方法參考吳小平等[8]制備赤芝原生質體的方法，對再生的菌株進行鏡檢，選取無鎖狀聯合的單核體作為標準測交菌株[8]。隨機選取一個單核菌株為T1，交配型定為AxBx；將能與其親和配對的單核菌株定為T2，交配型定為AyBy，并將其作為標準測交菌株。

1.5交配型分析

采用三輪雜交法進行常規交配型分析[9]，以標準菌株T1和T2作為測試菌株，將孢子單核體作為待測菌株進行配對，以鎖狀聯合為標記進行親和與否的判定，以此進行單核體的交配型分析，與標準測交菌株均不親和的任選一個為測交菌株T3，將與T3親和的菌株定為T4。

1.6交配型χ2測驗

通過卡方測驗對原生質體單核化菌株及4種擔孢子萌發的單核體進行檢測，驗證不同交配型的單核體的比例是否符合預期原生質體單核化單核體1∶1及孢子單核體1∶1∶1∶1的比例[10]。

1.7單核菌株交配型準確測定

1.7.1OWE-SOJ反應

參考Darmono TW的方法將4種交配型T1、T2、T3、T4兩兩配對接種于OWE培養基上，兩接種塊間相距約0.5 cm。25℃對峙培養7 d～10 d。當接種塊菌絲接觸后，將兩接種塊沿配對區垂直整條切出寬4 mm，長1.5 cm的瓊脂條，轉接入SOJ培養基中。25℃培養10 d～15 d觀察菌落形態。如果出現無鎖狀聯合的絨毛狀菌落，為A=B≠的反應；出現無鎖狀聯合的柵欄型菌落，則為A≠B=的反應[11]。

1.7.2核遷移測定

四級性的異宗結合交配系統，是由A和B兩個交配型因子控制。當2個單核菌株A因子相同B因子不同時，會出現核遷移現象，但不形成鎖狀聯合結構。具體操作步驟參考陳莉[12]的方法，取單核菌株T1分別與T3及T4菌株進行第一次配對。待菌絲交接后，取T1外側的菌塊與T4配對，取T3外側的菌塊與T2配對。觀察第二次配對是否可親和，如果可親和，則T1與T3間存在核遷移，其B因子不相同。反之則T1與T3間無核遷移，由此可以推測T3和T4的交配型。

2　結果與分析

2.1紫芝子實體及擔孢子形態

紫芝子實體及擔孢子形態見圖1。

圖1　紫芝子實體及擔孢子形態Fig.1Fruit body and basidiospores morphologies of Ganoderma sinense

由圖1可見，紫芝子實體呈半圓形、腎形或如意形，人工段木栽培條件下也常呈現近圓形；子實體皮殼成紫黑色，具有漆樣光澤；菌蓋表面有同心環紋。菌管層表面呈淺褐色，成熟后則呈褐色。菌柄側生，同菌蓋類似具有漆樣光澤。紫芝擔孢子呈卵形，相較赤芝擔孢子要大。頂端呈臍突形，或稍平截，雙層壁，外壁透明，內壁平滑，內壁淡褐色有明顯小刺，成熟擔孢子大小為（10～12）μm×（6.5～8.0）μm。

2.2標準測交菌株及擔孢子單核體分離

單核體菌株分離見圖2。

圖2　單核體菌株分離Fig.2Obtained monokaryogenesis

通過原生質體再生，共挑取了50個再生菌株，經鏡檢篩選獲得了29個單核菌株，單核化率為58.00%。試驗過程發現紫芝的原生質體單核化率與制作原生質體所采用的菌絲培養時間關系密切，幼嫩的菌絲體更易再生且獲得單核菌株。利用擔孢子萌發的方式，共獲得紫芝孢子單核體31個。因為擔孢子是減數分裂的產物，存在廣泛的變異，具體表現在不同單核菌株間生長速度和菌落形態存在明顯差異。

2.3交配型結果分析

通過親和配對，將原生質體單核化獲得的單核菌株分為T1和T2兩類，并以其作為標準菌株進行孢子單核體的親和配對。通過常規三輪雜交配對，結果見表1。

由表1可見，通過χ2驗證表明，原生質體單核化2種交配型的分離比例符合預期，孢子單核體的分離比例也符合1∶1∶1∶1的自由分離定律。

2.4交配型準確測定結果

表1　紫芝原生質體單核化及單核菌株的交配型分析Tab.1Analysis on mating type of monokaryons

通過OWE-SOJ技術進行不同孢子單核體間的配對，見圖3。從圖3可以觀察到3種不同的結果，無鎖狀聯合的柵欄菌落、有鎖狀聯合的絨毛狀菌落和無鎖狀聯合的絨毛狀菌落。通過不同交配型因子的單核體間配對反應類型的不同，可以推測出T3和T4的交配型應為AXBY和AYBX。

圖3　不同孢子單核體配對的OWE-SOJ反應類型Fig.3Interaction types of confrontation culture of different monospores using OWE-SOJ technique

利用核遷移技術進一步驗證OWE-SOJ反應的結果，再次驗證T3和T4的交配型，結果見圖4。

圖4　紫芝單核菌絲的核遷移Fig.4Nuclear migration of Ganoderma sinense

由圖4可見，將T1與T3進行第一次配對后，再與不親和的T4和T2進行配對，通過鏡檢第二次配對發現鎖狀聯合，所以可以推斷T1和T3、T2和T4之間存在核遷移現象，T1和T4、T2和T3之間不存在核遷移。因此可以推定紫芝4種孢子單核體的準確交配型為：T1（AXBX）、T2（AyBy）、T3（AXBY）和T4（AYBX）。

3　討論

紫芝為四級性異宗結合菌類，其交配型受兩對獨立的交配型因子控制。其中交配型因子A控制菌絲融合和鎖狀聯合的形成，B因子則控制細胞核遷移。擔孢子萌發獲得的單核體根據交配型不同可以分為四類，通過與標準測交菌株配對可以獲得親本型和非親本型的單核體。本研究獲得的孢子單核體符合預期的自由分離比例，但非親本型的單核體多于親本型，這可能與擔孢子的萌發率或挑取的單核體數量不足有關。陳裕新等[13]發現可以使用OWESOJ技術研究赤芝交配型因子。本研究采用OWESOJ技術與和遷移技術相結合，既可以克服OWESOJ反應中反應形態不夠明顯，也可以解決核遷移試驗中鎖狀聯合不易觀察的問題[13]。二者相互驗證可以準確測定T3和T4的交配型，為下一步開展品種選育與改良試驗奠定基礎。

本研究并沒有發現重組型的交配型因子出現，這可能與交配型因子中各亞基的距離較近，重組率較低有關。隨著全基因組測序工作的開展，赤芝的交配型因子結構已經繪制，這將有助于指導交配型因子的深入研究[14]。同時研究過程中發現，不同的孢子單核體在菌落形態、生長速度等方面具有多態性。孢子單核體遺傳多樣性的深入研究，將有助于挖掘品種特性，并應用于紫芝品種改良和遺傳研究。

[1]林志彬.靈芝的現代研究(第三版)[M].北京：北京大學醫學出版社，2007：3-8.

[2]戴玉成，楊祝良.中國藥用真菌名錄及部分名稱的修訂[J].菌物學報，2008，27（6）：801-824.

[3]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：174.

[4]鐘禮義.紫芝新品種“武芝2號”[J].農村百事通，2013（16）：39.

[5]劉新銳，王圣銪，謝寶貴，等.紫芝不親和性因子分析[J].菌物學報，2014，33（2）：464-468.

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[10]董洪新，蔡德華，李玉.豬肚菇擔孢子交配型的分析[J].微生物學報，2010，37（11）：1617-1620.

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[14]吳弘毅.靈芝交配型與出菇相關基因之選殖與分析[D].臺北市：國立臺灣大學，2005：80-85.

Accurate Determination of Mating Type of Ganoderma sinense Basidispores

KE Bin-rong1,LU Zheng-hui1,WU Xiao-ping2,GUO Li-xian2,LAN Qing-xiu1
（1.Edible Fungi Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences,National and Local Joint Engineering Research Center for Breeding&Cultivation of Featured Edible Fungi,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350014,China; 2.Mycological Research Center of Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China）

Four mating types of basidispores from Ganderma sinense were determined using three-cycle mating system,OWESOJ technique and nuclear migration test.Test results showed that G.sinense was a kind of basidiomycete with tetrapolarity heterothallism.The different mating types of protoplasted monokaryon and basidispores were present in a 1:1 and 1:1:1:1 ratio. The nuclear migration test is consist with that of OWE-SOJ,and they could establish corroboration for each other.Therefore it was feasible to apply this method to determine the mating type of basidispores accurately.

Ganoderma sinense;mating type;tetrapolarity;nuclear migration;OWE-SOJ

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0024-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.006

福建省種業創新與產業化工程專項項目（2014S1477-21)；福建省食用菌產業重大農技推廣服務試點項目（KNJ153013)。

柯斌榕（1986-），男，碩士，研究實習員，主要從事食（藥）用菌栽培及育種。E-mail:kebinrong@qq.com

**通信作者：吳小平（1965-），男，博士，教授，主要從事食用菌教學與科研工作。E-mail:fjwxp@126.com

2016-05-28