超干燥基質保藏杏鮑菇菌種及其特性和生產性能*

艾柳英，呂書儀，張杰，陳文星，賴春芬，王洪滔，孫淑靜

（福建農林大學生命科學學院，福州金山350002）

〈產業論壇〉

超干燥基質保藏杏鮑菇菌種及其特性和生產性能*

艾柳英，呂書儀，張杰，陳文星，賴春芬，王洪滔，孫淑靜**

（福建農林大學生命科學學院，福州金山350002）

菌種退化是食用菌在保藏過程中易出現的一個難題。該研究通過比較分析由超干燥基質保藏分離的杏鮑菇菌株Ple-tm與子實體組織分離的菌株Ple-fs的形態特征、生長速度及酶活，探索超干燥基質保藏法的可行性。研究結果顯示，菌株Ple-tm菌絲生長潔白濃密，生長速度明顯快于菌株Ple-fs，分別為1.08 cm·d-1和0.86 cm·d-1，兩者間具有極顯著差異。酶活測定結果表明Ple-tm各酶活均高于同期生長的Ple-fs，漆酶、錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶活分別為205.65 U·L-1、446.55 U·L-1、2.34 U·L-1、40.77 U·L-1和22.93 U·L-1。經出菇培養，Ple-tm比Ple-fs具有明顯優勢，產量為27.28 g·瓶-1，生物學效率比Ple-fs高26.3%，Pletm的菌絲生長速度、菌株生長周期、產量均保持原種優勢。該實驗表明超干燥基質保藏法可有效防止菌種退化，為食用菌菌種保藏方法的探究開辟新思路。

杏鮑菇；菌種退化；原種優勢；生物學效率

食用菌菌種是食用菌生產的重要生產資料[1]，菌種的質量直接影響食用菌的栽培結果，是影響經濟效益的關鍵因素之一[2]。菌種在栽培和保藏過程中，如果營養或培養環境控制不當，其生長代謝，菌種次生代謝物數量及質量均會受到影響[3]，發生退化現象。表現為菌種出現菌落生長速度不一致，菌絲體“吃料”速度減慢，出菇期延長，菇潮不明顯，品質、產量下降，抗性降低等。此外，菌絲的代謝能力[4]、菌絲對基質降解能力，影響菌株生產周期的胞外酶活力[5-6]也會發生變化。菌種退化原因來自多方面，由遺傳學、細胞學及基因突變[7]等因素導致的退化于常規條件不易改變，但保藏方法、繼代次數的影響卻可以優化和避免。目前常用的保藏方法有低溫定期移植保藏法[3]、冷凍干燥保藏法和液氮超低溫保藏法，3種方法均需要低溫，成本高。其中低溫定期移植保藏法需要每隔4月～6月移植轉管1次[7]，易增加繼代次數，不利于長期保藏。目前盡管不斷有新品種被發現與研究，但品種的老化或退化現象依然普遍存在。菌種保藏技術成熟與否關系到食用菌產業的進一步發展，因此，對菌種長期保藏技術的探究具有重要意義。

杏鮑菇（Pleurotus eryngii Quel），別名剌芹側耳，屬真菌門（Eumycota）擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）側耳科（Pleurotaceae）側耳屬（Pleurotus）。因其具有杏仁香味和菌肉肥厚如鮑魚的口感[8]，是近年來開發栽培成功的集食用、藥用于一體的珍稀食用菌新品種[9]，深受廣大消費者喜愛，已成為當今國內市場最具發展潛力的食用菌品種之一[10]。目前，中國、日本、韓國等都已實現杏鮑菇工廠化周年栽培[11]，在我國栽培主要集中于山東、河南、江西、福建、臺灣等地。但杏鮑菇生產過程中易出現菌種退化現象，即專用菌種[9]的退化，因此，對專用菌種保藏技術的探究尤為重要。

本研究以杏鮑菇為試材，首次采用超干燥基質保藏法，通過對超干燥基質保藏分離的杏鮑菇菌株Ple-tm與子實體組織分離的菌株Ple-fs的形態特征、生長速度及酶活比較分析，探索超干燥基質保藏法的可行性。該研究將為杏鮑菇菌種保藏提供新方法，并為食用菌菌種保藏提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

Ple-tm為試管超干燥基質保藏3年后分離所得的杏鮑菇菌株，首次從子實體分離；Ple-fs為杏鮑菇成熟子實體直接組織分離菌株，二者均為實驗室保藏的同種杏鮑菇菌種。

1.1.2供試培養基

超干燥基質培養基：木屑25%、麩皮35%、玉米芯24%、玉米粉5%、米糠10%、石灰1%，含水量30%。

PDA加富培養基（1L）：葡萄糖20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、KH2PO41.5 g·L-1、蔗渣1 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.5 g·L-1、瓊脂20 g·L-1，pH自然。0.11 MPa、121℃高壓滅菌20 min。液體培養基不加瓊脂。

生產培養基：木屑32.5%、玉米芯35%、麩皮15%、玉米粉5%、米糠10%、碳酸鈣1.5%、石灰1%，含水量65%，pH6.5～7.0。

1.2方法

1.2.1超干燥基質保藏法

超干燥基質保藏法的具體做法：按照超干燥基質培養基配方，配制試管保藏基質，121℃，180 min滅菌冷卻，每個試管接種1個杏鮑菇菌塊（直徑1 cm），于24℃恒溫培養箱中培養至菌絲長滿試管（約2個月），然后轉移至室溫避光保藏。

1.2.2菌絲生長速度與生物量測定試驗

固體培養：將菌株Ple-tm、Ple-fs接種于PDA加富培養基，轉接2次，24℃恒溫培養10 d，每個菌株做3個重復，每隔1 d測量菌絲生長直徑、觀察菌絲形態。

液體培養：將菌株接種至裝有100 mL完全培養基的250 mL三角瓶中，每瓶7塊（直徑1 cm），每個菌株做3個重復，120 r·min-1，24℃搖床培養9 d，測定菌株生物量濕重與干重。

1.2.3粗酶液的提取

從第3天開始，每隔3 d取一次上述液體培養發酵液，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，即為粗酶液。

1.2.4酶活測定

參照文獻方法[12]，分別測定兩菌株分別于3 d、6 d、9 d的漆酶、錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶的酶活。

1.2.5出菇試驗

根據生產培養基配方，以栽培料干重50 g·瓶-1的標準配備，裝入300 mL栽培瓶中，每個菌株設置14個重復，按照工廠化栽培流程培養至收獲。

收集子實體，記錄產量，計算生產周期、生物學效率。生產周期為接種發菌到采收完畢時間。

1.3數據處理

數據統計分析采用DPS 7．05數據處理軟件，采用單因素方差分析法進行差異顯著性檢驗。

2　結果與分析

2.1菌株菌絲生長速度及生物量

菌株菌絲生長速度及生物量見表1，菌絲生長形態特征見圖1。

表1　超干燥基質保藏杏鮑菇的菌絲生長速度及生物量Tab．1Mycelial growth rate and biomass of Pleurotus eryngii strain from the strain preservation of ultra dry substrate

圖1　超干燥基質保藏杏鮑菇菌株的菌絲形態特征Fig．1Mycelial morphology characteristics of Pleurotus.eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

由表1可知，菌株Ple-tm生長直徑為8．63 cm，生長速度為1．08 cm·d-1，明顯快于菌株Ple-fs。兩者菌絲生長直徑和速度均達極顯著差異。菌株Ple-tm和Ple-fs菌絲生物量干重分別為1．07 g/100mL和 0．95 g/100mL，相比無明顯差異；菌絲濕重達極顯著差異。

由圖1可知，Ple-tm長勢均勻，菌絲潔白濃密，邊緣整齊，優于Ple-fs。兩者菌絲生長速度差異較大，Ple-tm生長速度較快，8 d長滿平皿，而Ple-fs生長較慢，10 d才長滿平皿。由此可知，保藏3年后分離得到的菌株Ple-tm生長活性依然高于Ple-fs，而后者顯現出較為明顯的菌種退化特征。

2.2酶活測定結果

漆酶、錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶、木聚糖酶、纖維素酶酶活力比較見圖2。

從圖2可知，2個菌株在不同酶活上都體現出一定差異。Ple-tm的5種主要酶活力最高分別為205．65 U·L-1、446．55 U·L-1、2．34 U·L-1、40．77 U·L-1和22．93 U·L-1，后4種較Ple-fs同期酶活達極顯著差異。

漆酶酶活力：前期（3 d～6 d）菌株Ple-tm漆酶酶活的較高，后期（9 d）Ple-fs菌株漆酶酶活上升，而Ple-tm漆酶酶活下降。推測由于菌株Ple-tm生長速度快于Ple-fs，后者生長滯后，于后期才表現出較高的酶活[4]（圖2A)。錳過氧化物酶活力：呈現與漆酶相似的趨勢（圖2B)。由圖2C可知，2個菌株前期木質素酶酶活力都較低，后期才表現出活性，Pletm酶活明顯高于Ple-fs。木聚糖酶活力：Ple-tm、Ple-fs菌株木聚糖酶酶活力都隨時間增加而升高，但菌株Ple-tm木聚糖酶酶活一直顯著高于Ple-fs；后期兩者仍較高但酶活已下降至第6天時的一半(圖2D)。可能由于培養基中的營養[2]消耗過快導致。纖維素酶活力：在菌絲生長階段（3 d～9 d）菌株Pletm、Ple-fs纖維素酶酶活力都隨時間增加而升高，但菌株Ple-tm纖維素酶酶活一直高于菌株Ple-fs，并在第9天達極顯著差異（圖2E）。

綜上可知，菌株Ple-tm的主要酶活皆優于同期Ple-fs菌株，由于酶活力高低程度與食用菌的生長發育及生物量息息相關[5]，體現了菌株生長活力和對基質的降解能力[6]，因此該結果間接表明Ple-tm菌株具有更強的生長代謝能力。

表2　超干燥基質保藏杏鮑菇菌株的出菇結果Tab．2Mushroom cultivation results of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

2.3出菇試驗結果

菌株Ple-tm、Ple-fs出菇結果見表2，在栽培料干重相同、培養條件一致的條件下，對比2個菌株菌絲滿袋、原基形成、出菇時間、出菇產量、生物學效率。2個菌株不同時期對照見圖3。

由表2可見，菌株Ple-tm在栽培過程中顯著地表現出原種優勢，在菌絲出現、滿袋、原基形成、子實體成熟時間、菌絲長勢及菇的質量等方面遠遠超過菌株Ple-fs，菌絲滿袋只用了17 d，出菇45 d，生物學效率為54．56%，而Ple-fs菌株長勢弱，出菇時間延長，品質下降，菌種退化嚴重。

圖2　超干燥基質保藏杏鮑菇菌株的5種酶活力Fig．25 kinds of enzyme activity of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

圖3　超干燥基質保藏杏鮑菇的菌株栽培對照Fig．3Mushroom cultivation comparison of Pleurotus eryngii strain from preservation of ultra dry substrate

3　討論

菌種是國家重要的生物資源，是生產、教學和科學研究的基本材料。菌種保藏過程中，不僅要保持菌種不死亡、不被雜菌污染，更主要的是保持菌種遺傳性狀不發生或盡可能少發生變異[13]。從1980年至今，世界各國都非常重視菌種的保藏工作，并作了大量研究[14]。本研究在前人的基礎上優化配方，探索出超干燥基質保藏法，該法在文獻中并無報道，也未應用于其他菌種。

研究表明，超干燥基質保藏法保藏3年后的菌株長勢、主要酶活及菌株生長周期均保持原種活性，與常規保種方法比較顯現絕對優勢。探究機理，筆者認為可以從以下三個方面考慮：超干燥條件下水分含量極少，不能滿足菌絲的進一步生長，使其生長停滯，保持于原有水平，且干燥環境不利于雜菌生長及營養物質的流失，因此，長期保藏之后菌種活性亦能保持；該方法僅需常溫保藏，菌絲長期生長停滯，但不受低溫刺激，既防止原基的生成，又使其保持于正常環境溫度內；保藏時需避光，亦是防止光照的刺激，理由同上。這與李紅等[7]提出的在保藏過程中光照、溫度刺激也可引起菌種退化的觀點一致，具體機理待進一步研究。

[1]劉新宇，祁玉良，熊在東，等.食用菌菌種退化的遺傳學分析[J].信陽農業高等專科學校學報，2001（2）：16-18.

[2]劉海英，董月香，周廷斌，等.食用菌菌種的退化及復壯[J].食用菌，2003（6）：16-17.

[3]赫朝燦.菌種退化的原因、處理措施及菌種保藏探析[J].生物技術世界，2015（2）：1.

[4]張淵，王謙，張筱梅，等.白靈側耳木質素酶、纖維素酶高活性菌株的誘變選育[J].河北大學學報：自然科學版，

Characteristics and Production Performance of Pleurotus eryngii Strain from Preservation of Ultra Dry Substrate

AI Liu-ying,LV Shu-yi,ZHANG Jie,CHEN Wen-xing,LAI Chun-fen,WANG Hong-tao,SUN Shu-jing
(College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Strain degradation appears easily in the strain preservation of edible fungi.In this study,in order to investigate the feasibility of ultra dry substrate used in strain preservation,the comparative analysis was performed by determining the mycelial morphology,growth speed and enzyme activity of Ple-tm strain isolated from preservation ultra dry substrate and Ple-fs strain isolated from Pleurotus eryngii fruitbody tissue.The results showed that the mycelial growth rate of Ple-tm(1.08 cm·d-1)was faster than that of Ple-fs(0.86 cm·d-1),and the difference was extremely significant.At the same time,the hyphae of Ple-tm were denser,neater and whiter.Moreover,the laccase,manganese peroxidase,lignin peroxidease,xylanase and cellulase activity of Ple-tm reached 205.65 U·L-1,446.55 U·L-1,2.34 U·L-1,40.77 U·L-1and 22.93 U·L-1,respectively.These enzymatic activities were significantly higher than those of Ple-fs during the same growth period.The mushroom cultivation experiments showed that the fruitbody production of Ple-tm strain reached 27.28 g per bottle and the biological efficiency was 26.3%higher than that of Ple-fs strain.Furthermore,Ple-tm strain could maintain the protospecies advantages in terms of mycelial growth rate,growth period and fruitbody production.These results showed that the strain preservation of ultra dry substrate can inhibit the strain degradation effectively,which will develop new strategies on the research of preservation methods of edible fungi.

Pleurotus eryngii;strain degradation;protospecies advantages;biological efficiency

S646.1

A

1003-8310（2016）04-0072-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.018

福建省食用菌產業重大農技推廣服務體系建設（KNJ-153011C）；福建省發改委農業五新工程項目（閩發改委投資[2012]931號）；福建省政府專項項目（K8114002A）；福建省食用菌產業重大研發平臺（2014N2101）；福建省發改委生物產業技術專項（2011878）。

艾柳英（1992-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向為食用真菌學。E-mail:1178884710@qq.com

**通信作者：孫淑靜（1978-），女，博士，副教授，主要從事食（藥）用菌子實體生長發育機理、食用菌酶制備、食用菌遺傳育種研究。

E-mail:shjsun2004@126.com

2016-05-18