健脾疏肝和胃方對功能性消化不良大鼠Cajal間質細胞及胃排空的影響

李曉燕，陳維，陳文玲

(云南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650031)

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健脾疏肝和胃方對功能性消化不良大鼠Cajal間質細胞及胃排空的影響

李曉燕，陳維*，陳文玲

(云南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650031)

目的:觀察健脾疏肝和胃方對功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D)大鼠胃排空(gastric emptying,GE)、c-Kit陽性Cajal間質細胞(interstitial cells of cajal，ICC)及其表達的影響，探討其可能的作用機制。方法:將大鼠隨機分成對照組、模型組、健脾疏肝和胃方組、多潘立酮組，采用夾尾刺激法建立FD大鼠模型，連續(xù)給藥14天后，采用半固體營養(yǎng)糊法觀察胃排空，胃高倍鏡下Cajal間質細胞計數，采用實時熒光定量PCR法檢測胃平滑肌組織kit mRNA表達，Western blot法檢測胃平滑肌組織kit表達。結果:與對照組相比，模型組胃排空延遲、胃底c-Kit 陽性ICC表達顯著降低(P均<0.05)；與模型組相比，健脾疏肝和胃方組及多潘立酮組胃排空、c-Kit 陽性ICC數量及表達顯著升高(P均<0.05)。結論:健脾疏肝和胃方組可以明顯增加FD大鼠胃底ICC表達，加快胃排空；上調ICC、提高大鼠胃排空率可能是健脾疏肝和胃方治療功能性消化不良的作用機制之一。

功能性消化不良；大鼠；健脾疏肝和胃方；Cajal間質細胞

功能性消化不良(functional dyspepsia，F(xiàn)D) 是一種臨床常見的消化道疾病，發(fā)病機理復雜，臨床治療藥物多樣，但病情容易反復。因此，尋找具有多靶點、療效確切、副作用小的防治藥物無疑是一項有意義的研究。

健脾疏肝和胃方是云南省名中醫(yī)帥燾教授臨床應用多年的治療肝胃不和之腹痛的經驗方，前期的臨床觀察[1]發(fā)現(xiàn)療效較好。本研究以FD大鼠為觀察對象，從Cajal間質細胞(interstitial cells of cajal，ICC)、胃排空(gastric emptying，GE)的層面，研究該方治療FD的可能作用機制。

1 材料

1.1 動物

40只SPF級SD大鼠，體質量(200±20)g，適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為正常對照組、模型組、西藥組和中藥組，每組10只。正常對照組正常喂養(yǎng)，其余3組均按照參考文獻[2]采用郭氏夾尾激怒法制造FD大鼠模型。

1.2 藥物

健脾疏肝和胃方(枳實10 g，白術20 g，柴胡12 g，白芍10 g，木香10 g，香附10g，延胡索10 g，川楝子8 g，厚樸20 g，檳榔10 g等)，購自云南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科;多潘立酮片(西安楊森制藥有限公司，批號140107137)。藥物制備方法:將中藥材按傳統(tǒng)方法水煎并加熱濃縮成浸膏，置4℃冷藏備用。

1.3 試劑與儀器

Rabbit Anti-C-KIT(BA0467，美國Santa cruz公司)；PCR擴增儀(美國ABI公司)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；冷凍離心機(德國thermo公司)；JY3002 型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 給藥方法

造模結束后開始灌胃給藥，按照大鼠與人臨床用藥劑量、體型系數公式dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3計算大鼠藥物劑量，中藥組給予健脾疏肝和胃生藥13.5 g/kg，陽性藥物對照組給予多潘立酮1.0 mg/kg，模型組及正常對照組給予生理鹽水,每日1次，連續(xù)14天。給藥14天后禁食不禁水24 h。

2.2 樣本處理

參照文獻[3]制作半固體糊，冰箱冷藏，用時恢復至室溫。末次給藥2 h后各組給予灌入半固體糊，1.0 g/只，40 min后斷頭處死大鼠。打開腹腔，結扎賁門和幽門，取下整胃，用濾紙拭干后稱胃全重。沿大彎側切開胃，以蒸餾水沖洗胃內容物，濾紙拭干后稱胃凈重。胃底部取胃壁全層大小約0.5 cm×0.5 cm 2塊，一塊置于2.5%戊二醛、液氮中，備電鏡檢測。一塊用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，片厚4 μm，烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，每次10 min。然后洗滌、修復液修復、浸泡，依次加入一抗、二抗，鏡下觀察，以棕黃色為陽性反應；PBS 沖洗，HE 染色、沖洗、酒精濾泡，中性樹膠封片觀察。

2.3 指標檢測

2.3.1 按照公式計算胃排空

胃排空率(%)=[1-(胃全重-胃凈重)/腹腔注射量]×100%

2.3.2 胃平滑肌組織kit mRNA表達

采用實時熒光定量PCR法(Real-time PCR)，以GAPDH 為內參，檢測kit的mRNA表達(步驟：提取組織總RNA-引物-逆轉錄cDNA-Real time PCR 反應體系擴增-目的基因相對mRNA表達水平分析)。

2.3.3 Western blot檢測胃平滑肌組織kit表達

提取蛋白樣品80 μg，SDSPAGE凝膠電泳分離，凝膠電泳儀初始電壓80 V，后提高電壓至100 V，用PVDF膜進行蛋白質的電轉移，用5%TBS-T脫脂奶粉封閉。用TBS-T漂洗液洗膜，加入用適當漂洗液稀釋的抗體(c-kit為1∶200；β-actin為1∶5000)，4℃孵育過夜。TBS-T漂洗液洗膜3次，然后將PVDF膜移入另一新的雜交袋，加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗(c-kit 為1∶2000；β-actin為1∶10000)，37℃振蕩60 min，TBS-T漂洗液洗膜。加入化學發(fā)光劑曝光、顯影。蛋白圖像分析用IPP軟件對掃描圖象的目的條帶進行分析。

2.3.4 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 基本情況

造模7天后，造模大鼠均有體質量增長緩慢、飲水、飲食量逐漸減少，毛發(fā)枯黃、不光滑等表現(xiàn)。

3.2 各組大鼠胃底ICC 表達比較

模型組大鼠胃底c-Kit mRNA及蛋白表達較正常對照組明顯減少(P<0.05);中藥組與模型組相比陽性表達增多，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1及圖1～3。

3.3 胃排空

模型組大鼠胃排空率較正常對照組明顯減少(P<0.05);中藥組與模型組相比胃排空率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中藥組與西藥組差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組大鼠胃底ICC 表達比較

注:與正常組相比，1)P<0.05;與模型組相比，2)P<0.05。

圖1 免疫組化檢測FD模型大鼠胃底肌肉層c-kit蛋白變化注:圖中所示為藥物干預后各組大鼠胃底肌肉層的免疫組化照片，1為空白對照組大鼠胃底肌肉層(×100)，2為模型對照組(×100)，3為西藥對照組(×100)，4為中藥組(×100)。

圖2 Western Blot檢測FD模型大鼠胃底肌肉層c-kit含量

3.4 Western Blot檢測c-kit蛋白表達結果

上圖為四組大鼠在藥物干預后Western Blot檢測c-kit蛋白的表達含量結果膠片掃描圖片；下圖為采用Bio-Rad的Quantity one軟件分析膠片后的c-kit不同組間表達趨勢變化。

3.5 RT-PCR檢測c-kit mRNA結果

圖3 RT-PCR檢測FD模型大鼠胃底肌肉層c-kit mRNA含量變化

相較于空白對照組的SD大鼠，模型對照組的大鼠胃底肌肉層中Cajal細胞含量都明顯降低。Western Blot方法檢測顯示模型對照組的c-kit蛋白含量為空白對照組的21.2%(P<0.05，見圖2)，RT-PCR方法檢測模型對照組c-kit mRNA含量為空白對照組的7.8%(P<0.05，見圖3)，免疫組化檢測顯示c-kit含量在模型對照組的SD大鼠胃底肌肉層的含量明顯低于空白對照組(P<0.05)(見圖1)，這說明SD大鼠的FD模型構建比較成功。而在藥物干預14天后，相較于模型對照組，西藥組和中藥組的大鼠胃底肌肉層的c-kit蛋白，c-kit mRNA，以及Cajal細胞含量都有所提升。其中西藥組的c-kit蛋白含量提升為239%，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥組提升為139%(P<0.05)，如圖2中所示；西藥組的c-kit mRNA含量提升為331%(P<0.05)，中藥組提升為159%(P<0.05)，見圖3；免疫組化照片顯示西藥組和中藥組大鼠胃底肌肉層中的Cajal細胞的含量也較于模型對照組有所提升(圖1)。中藥組較西藥組低且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

4 討論

FD的發(fā)病機制復雜多樣，研究顯示30%～80% 的FD 患者存在消化道運動障礙[4]。目前已證實ICC 在胃腸電生理和動力發(fā)生及動力障礙機制上具有重要作用[5]。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠胃竇c-Kit 陽性ICC與對照組比較明顯減少(P<0.05)，并且胃排空率明顯降低，ICC數量下降可能導致胃腸平滑肌松弛，胃蠕動減弱，從而出現(xiàn)胃排空時間延長等功能障礙。用健脾疏肝和胃方治療后，大鼠c-Kit mRNA及蛋白陽性表達均較模型組增加、胃排空率顯著升高(P均<0.05)。中藥組與模型組相比各項指標升高且差異無統(tǒng)計學意義。綜上，健脾疏肝和胃方促進胃排空，可能通過上調ICC表達有關，但可能還存在其他作用機制，有待于今后進一步研究。

[1] 李曉燕，石穎．健脾疏肝和胃法治療功能性消化不良42例[J].中國中西醫(yī)結合消化雜志，2012,20(3)：128-129.

[2] 郭海軍,林潔,李國成,等.功能性消化不良的動物模型研究[J].中國中西醫(yī)結合消化雜志,2001,9(3):141-142.

[3] 孫永順，尚盈盈，朱生樑.丁香降氣方對反流性食管炎大鼠胃排空及Cajal間質細胞影響的實驗研究[J].新中醫(yī)，2012，44(10)：130-133.

[4] 張曉光，胡品津，林金坤，等.功能性消化不良患者胃感覺運動功能的研究[J].中華消化雜志，2003，23(4) :227-229.

[5] Daniel EE. Communication between interstitial cells of Cajal and gastrointestinal muscle[J].Neuro gastroenterol Motil，2004，16(1):118.

Effect of Jianpi Shugan Hewei Decoction on Expression of Interstitial Cells of Cajal in Functional Dyspepsia Rats

LI Xiao-yan，CHEN Wei*，CHEN Wen-ling

(TheFirstAffiliatedHospitalofYunanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650031，China)

Objective:To observe the effect and mechanism of Jianpi Shugan Hewei decoction on expression of gastric emptying and interstitial cells of cajal(ICC) in functional dyspepsia(FD) rats. Methods:FD model was induced by moderately enraging the rats' tail. All rats were randomly divided into 4 groups:a control group，a model group，a Chinese herbology group and a western medicine group. Drugs were administrated for 14 days. ICC and GE were determined by immunohistochemical method. Gastric emptying was observed with phenolsulfonphthalein. Results:Compared with the control group，gastric emptying and the expression of ICC in the model group were obviously decreased (P<0.05). Compared with the model group，gastric emptying and ICC increased significantly in Chinese herbology group and western medicine group(P<0.05). Conclusion: Jianpi Shugan Hewei decoction may increase diet and water intake，promote ICC expression in FD rats and accelerate gastric emptying.

Functional dyspepsia;Rats;Jianpi Shugan Hewei decoction;Interstitial cells of Cajal

云南省教育廳課題(No.2013Y235)

李曉燕(1975-)，女，副教授，主要從事脾胃病及老年病的臨床教學及科研工作。

陳維*(1979-)，男，講師，主治醫(yī)師，博士，主要從事中西醫(yī)結合內科學臨床、科研與教學工作。

2015-10-21

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0045-03

修回日期：2015-11-10